潘龍，?？←?，卜登攀，杜洪，程建波，孫先枝，王秀敏，秦俊杰，袁耀明，張幸開

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.CAAS-ICRAF農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030；4.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206；5.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海 200436)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

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柴胡皂苷對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)及細(xì)菌數(shù)量變化的影響

潘龍1**，?？←?**，卜登攀1,2,3*，杜洪1，程建波1，孫先枝1，王秀敏4，秦俊杰4，袁耀明5，張幸開5

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.CAAS-ICRAF農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030；4.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206；5.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海 200436)

研究柴胡皂苷(SSA)對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)及發(fā)酵液中菌群變化的影響。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在0.5 g全混合日糧(TMR)中分別添加0，0.125，0.25和0.5 mg的SSA，通過AGRS-III微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動(dòng)記錄儀在39℃條件下進(jìn)行48 h體外發(fā)酵，并通過實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測發(fā)酵液中菌群相對(duì)含量的變化。結(jié)果表明，0.25 g/kg的SSA提高了干物質(zhì)降解率(DMD，P=0.08)和總產(chǎn)氣量(GP，P<0.05)，并提高了發(fā)酵液中揮發(fā)酸(VFA)的含量(P<0.05)，而0.5和1.0 g/kg的SSA對(duì)GP和DMD沒有顯著的影響，但是提高了乙酸和TVFA的含量(P<0.05)。SSA提高了白色瘤胃球菌和牛鏈球菌的相對(duì)含量(P<0.05)；但降低了短普雷沃氏菌和噬淀粉瘤胃桿菌的相對(duì)含量(P<0.05)。因此，SSA提高了體外GP和VFA濃度，并改變發(fā)酵液中細(xì)菌的含量，這表明SSA有利于調(diào)控微生物體外發(fā)酵參數(shù)。

柴胡皂苷；體外發(fā)酵；細(xì)菌數(shù)量

柴胡是傳統(tǒng)中藥，含有豐富的化學(xué)成分，包括柴胡皂苷、甾醇、脂肪油、揮發(fā)油和多糖等[1-3]，具有解熱退燒、鎮(zhèn)靜安神、抗炎抗病毒、提高免疫力等多種生物活性[4]，因此具有很高的營養(yǎng)和藥用雙重價(jià)值[5]。本課題研究表明，柴胡中草藥添加劑可以緩解奶牛熱應(yīng)激并提高其泌乳性能[6]，但其緩解畜禽熱應(yīng)激的效果及機(jī)制尚不明確[7]。

長期大量使用柴胡添加劑會(huì)對(duì)肝臟有一定的損傷作用[8]。柴胡水提物可致小鼠肝臟損傷，其毒性機(jī)理可能與小鼠肝臟的氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡受到破壞有關(guān)[9]。柴胡總皂苷醇洗脫物損傷肝組織，且隨著劑量增大損傷程度越嚴(yán)重，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶也顯著升高；不同劑量的總皂苷醇洗脫物對(duì)小鼠肝組織出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞水腫和脂肪變性，其中高劑量甚至出現(xiàn)組織片狀壞死、小葉結(jié)構(gòu)不清等不良癥狀[10]。此外，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)柴胡可抑制胃液分泌，降低胃蛋白酶活性[11]；高劑量的柴胡水提液還可抑制正常動(dòng)物的胃排空和腸蠕動(dòng)[12]。因此，使用柴胡中草藥時(shí)一定要慎重考慮其適宜的添加劑量，才能充分發(fā)揮其潛在的生物學(xué)功效[13]。

植物皂苷類物質(zhì)調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵越來越受到廣泛關(guān)注[14]。1%～3%的苜蓿皂苷降低瘤胃發(fā)酵液pH值，提高總揮發(fā)酸(total volatile fatty acids，TVFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)的濃度[15]；但1%～3%的苜蓿皂苷降低瘤胃原蟲培養(yǎng)液TVFA濃度，2%和3%的苜蓿皂苷降低了培養(yǎng)液微生物蛋白(microbial crude protein，MCP)濃度[16]；鳳仙花明顯降低甲烷生成，促進(jìn)NH3-N向MCP轉(zhuǎn)化，改變了瘤胃代謝模式[17]；蒺藜皂苷降低體外發(fā)酵液NH3-N和乙酸濃度，但提高丙酸濃度以及飼料能量和蛋白質(zhì)的利用效率[18]；皂樹苷和絲蘭皂苷可直接刺激一些瘤胃細(xì)菌的發(fā)育，從而提高飼料消化率[19]；絲蘭皂苷降低NH3-N濃度，但提高瘤胃淀粉桿菌、普雷沃菌和丁酸弧菌的豐度[20]，苜蓿皂苷的發(fā)酵液中主要細(xì)菌類型為鏈球菌[21]等。由此可知，多種皂苷可以改變瘤胃發(fā)酵參數(shù)，并改變其中細(xì)菌含量而優(yōu)化瘤胃發(fā)酵。

藥理學(xué)研究表明，柴胡具“營養(yǎng)”和“藥用”的雙重價(jià)值，其主要活性成分為柴胡皂苷[5]。目前，柴胡皂苷(SSA)主要應(yīng)用于提高機(jī)體抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[4]，而應(yīng)用于調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)通過體外法研究SSA對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)的影響，從而為優(yōu)化瘤胃發(fā)酵提供選擇參考。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)氣裝置與產(chǎn)品來源

產(chǎn)氣裝置為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊紅建老師發(fā)明的AGRS-III微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動(dòng)記錄儀(Automated Trace Gas Recording System for Microbial Fermentation, 簡稱AGRS)。柴胡皂苷A(saikosaponin A，SSA)于2014年1月購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

準(zhǔn)確稱取約0.5 g飼料樣品(按牛場日糧配制成全混合日糧，total mixed ration，TMR)于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，按照完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，4種處理添加量分別為0，0.25，0.5和1.0 g/kg，將每個(gè)瓶中分別加入相應(yīng)SSA劑量(0，0.125，0.25和0.5 mg；由于SSA易潮解且量極少，稱量困難，為此，配成1 mg/mL溶液，即加入0，125，250，500 μL)，每處理5個(gè)重復(fù)。接種時(shí)迅速將每個(gè)瓶中加入預(yù)熱的緩沖液50 mL和4層紗布過濾的新鮮瘤胃液25 mL，并向瓶中持續(xù)通入CO25 s后，立即加上瓶塞，并將每個(gè)發(fā)酵瓶與產(chǎn)氣裝置的每個(gè)傳感器相連接，于39℃下連續(xù)培養(yǎng)48 h，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 樣品采集與測定分析

1.3.1 瘤胃液樣品采集與處理 2014年1月在北京市順義區(qū)某奶牛場通過瘤胃瘺管采集3頭健康奶牛晨飼前的瘤胃內(nèi)容物，混合后裝于保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，39℃水浴環(huán)境中用4層紗布過濾，同時(shí)通入CO2，然后邊攪拌邊加入?yún)捬醢l(fā)酵瓶，操作應(yīng)在盡量短的時(shí)間內(nèi)完成[22]。

1.3.2 發(fā)酵液樣品采集與處理 發(fā)酵48 h后結(jié)束發(fā)酵程序，從發(fā)酵瓶中采集發(fā)酵液，即時(shí)測量發(fā)酵液pH；并采集10 mL發(fā)酵液，-20℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)指標(biāo)的測定和DNA提取[23]。對(duì)剩余的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，用于體外干物質(zhì)降解率(dry matter digestibility，DMD)指標(biāo)的測定[24]。

1.3.3 DNA提取和細(xì)菌相對(duì)定量 通過CTAB珠磨法提取發(fā)酵液中DNA[25]；利用引物在ABI 7500 Real-Time PCR System上進(jìn)行qPCR相對(duì)定量。qPCR擴(kuò)增體系如下：5.0 μL SYBR? Premix Ex Taq?(2×)，0.3 μL PCR上游引物(10 μmol/L)，0.3 μL PCR下游引物(10 μmol/L)，0.2 μL ROX Reference Dye Dye II(50×)，1 μL DNA樣品(稀釋至10 ng/μL)，3.4 μL ddH2O，總體積為10 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，55℃ 34 s，72℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。以空白組相應(yīng)Ct值為對(duì)照，將樣品各種菌和總菌的Ct值通過公式2-ΔΔCt(2-[Δ(Ct樣品-Ct總菌)-Δ(Ct空樣-Ct空總)])得到相對(duì)百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2003軟件初步整理后，采用SAS 9.2軟件中的GLM模型進(jìn)行分析。采用Tukey方法進(jìn)行多重比較，以最小二乘均數(shù)形式表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果，差異顯著水平為P<0.05，趨于顯著水平為0.05≤P<0.10。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡皂苷對(duì)體外產(chǎn)氣的影響

SSA對(duì)發(fā)酵液的pH沒有顯著影響(表1)，但是0.25 g/kg的添加量趨于(P=0.08)提高DMD(圖 1)，同時(shí)也提高了總產(chǎn)氣量(gas production，GP，P<0.05)；而0.5和1.0 g/kg的添加量具有提高DMD和GP的趨勢，但差異均不顯著(圖2)。

表1 柴胡皂苷A對(duì)體外產(chǎn)氣的影響

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:The different small letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

2.2 柴胡皂苷對(duì)發(fā)酵液中揮發(fā)酸含量的影響

由表2可知，SSA對(duì)VFA的影響較大，其中0.25 g/kg的添加量提高了丙酸和丁酸含量(P<0.05)，0.25，0.5和1.0 g/kg的添加量均提高了乙酸和TVFA的含量(P<0.01)，對(duì)乙丙比影響不顯著(P>0.05)，并沒有改變瘤胃的發(fā)酵模式。

2.3 柴胡皂苷對(duì)發(fā)酵液中微生物數(shù)量的影響

由表3可以看出，SSA提高了白色瘤胃球菌和牛鏈球菌的含量(P<0.05)，并有提高布氏普雷沃氏菌的(P=0.08)與脂厭氧弧菌(P=0.04)的趨勢；但卻降低了短普雷沃氏菌、噬淀粉瘤胃桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的含量(P<0.05)，有降低產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的趨勢(P=0.08)。

圖1 柴胡皂苷A對(duì)DM體外降解率的影響Fig.1 Effect of SSA on DMD in vitro

圖2 柴胡皂苷A對(duì)體外產(chǎn)氣量的影響Fig.2 Effect of SSA on GP in vitro

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

表2 柴胡皂苷A對(duì)發(fā)酵液揮發(fā)酸含量的影響

表3 柴胡皂苷A對(duì)發(fā)酵液中微生物相對(duì)含量的影響

3 討論

體外研究表明低劑量的皂樹苷和絲蘭皂苷可直接刺激一些瘤胃細(xì)菌的發(fā)育，包括纖維分解菌，從而提高飼料消化率，并能調(diào)節(jié)瘤胃微生物群落，且有劑量依賴性；而高劑量皂苷在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵特性上與驅(qū)除原蟲類似[19]。絲蘭皂苷可能由于直接抑制了蛋白降解菌，從而降低了氨氮濃度；但其增加了瘤胃新月形單胞桿菌和瘤胃淀粉桿菌、瘤胃普雷沃菌和丁酸弧菌的豐度，盡管增加幅度較小[20]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，低劑量的SSA的添加提高了DMD，也相應(yīng)提高了體外GP，但是高劑量的添加卻又導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)降低的趨勢(表1)。GP高(圖1)表明飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動(dòng)劇烈，這和DMD的趨勢(圖2)相互驗(yàn)證。但也有研究表明絲蘭皂苷并沒有影響DMD[26]，這可能與皂苷的類型和添加劑量有關(guān)。

添加劑量為75 mg/L的絲蘭皂苷時(shí)可顯著提高VFA產(chǎn)量，而225 mg/L添加劑量使VFA產(chǎn)量降低[27]，本試驗(yàn)也表明0.25 g/kg的SSA提高了丙酸和丁酸的含量，而0.5和1.0 g/kg的添加量又有降低的趨勢(表2)；但是也有研究表明體外添加皂樹皂苷[28]、絲蘭提取物[26]或無患子果實(shí)[29]對(duì)總VFA產(chǎn)量沒有影響；洋槐(black locust)皂苷提高了丙酸的濃度，但對(duì)TVFA沒有顯著影響[30]；混合日糧中添加125 mg/kg絲蘭皂苷顯著提高了丙酸濃度，但對(duì)于精料型日糧的效果不明顯[31]。此外，pH為5.5時(shí)，30 mg/L 絲蘭屬植物(含8%皂苷)提高丙酸濃度，降低乙酸比例，但在pH為7.0時(shí)則沒有效果[32]。因此，皂苷對(duì)瘤胃VFA產(chǎn)量的作用效果可能與皂苷的來源、添加量、日糧精粗比和瘤胃pH有關(guān)。本試驗(yàn)表明柴胡皂苷的添加(0.25，0.5 和1.0 g/kg)均提高了乙酸和總揮發(fā)酸的含量(表2)，這與其他報(bào)道相一致[33]。

瘤胃作為一個(gè)龐大的菌種資源庫，存在著大量的微生物。反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料的利用能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單胃動(dòng)物，主要?dú)w功于瘤胃中棲息的微生物菌群。由于瘤胃中細(xì)菌和真菌的種類不同，對(duì)皂苷的敏感度也有所不同。毛瓣無患子(Sapindusrarak)皂苷濃度小于1 mg/mL時(shí)，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌不受其影響，但是當(dāng)其濃度添加到2～4 mg/mL時(shí)，其數(shù)量都顯著下降[34]。毛瓣無患子皂苷在短時(shí)間內(nèi)能夠抑制白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌，而105 d后，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌均不受影響[35]。因此，不同種類的皂苷及不同的作用時(shí)間對(duì)瘤胃細(xì)菌的影響均可能不同。葫蘆巴籽皂苷和印度田菁葉子的皂苷使產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的含量分別提高42%和45%，而飛廉植物葉子和葫蘆巴籽皂苷可使黃色瘤胃球菌的數(shù)量提高40%[36]。苜蓿皂苷(8～16 g/d)顯著提高了綿羊瘤胃中主要纖維分解菌(產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌及白色瘤胃球菌)占總細(xì)菌數(shù)的相對(duì)含量[37]。鮮沙蔥和提取物能夠顯著提高瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌相對(duì)數(shù)量，但對(duì)黃化瘤胃球菌的相對(duì)數(shù)量沒有顯著影響[38]。而本試驗(yàn)研究表明，1.0 g/kg的SSA提高了白色瘤胃球菌的數(shù)量，但又有降低產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量的趨勢(表3)。這與上述研究不同，可能由于不同來源的皂苷或者作用時(shí)間長短對(duì)瘤胃微生物的影響不盡相同。

絲蘭皂苷對(duì)于淀粉分解菌的抑制作用因種屬差異變化較大，皂苷可抑制牛鏈球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的生長，而對(duì)反芻獸新月形單胞菌的生長卻有刺激作用[27]。而該試驗(yàn)表明，0.5 g/kg的SSA抑制了棲瘤胃普雷沃氏菌的含量，不同劑量均抑制了噬淀粉瘤胃桿菌，這與上述研究結(jié)果一致，但是SSA顯著提高了牛鏈球菌的數(shù)量，這與其他學(xué)者研究結(jié)果相反。關(guān)于皂苷對(duì)某些細(xì)菌的促生長作用機(jī)理尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為，可能與皂苷對(duì)原蟲的抑制作用有關(guān)[39]，或者是因?yàn)榈蛣┝康脑碥帐辜?xì)胞膜的滲透作用增強(qiáng)，進(jìn)而使細(xì)菌細(xì)胞能夠吸收更多的養(yǎng)分[40]。生產(chǎn)中可利用皂苷對(duì)不同微生物的影響調(diào)控瘤胃代謝，如飼喂精料型日糧的反芻動(dòng)物，其瘤胃內(nèi)牛鏈球菌的數(shù)量較多，促使可溶性淀粉迅速發(fā)酵為乳酸，乳酸過多易引起瘤胃酸中毒，因而在高精料日糧中添加適量皂苷則可通過抑制牛鏈球菌的生長而減少酸中毒的發(fā)生率[41]。因此，研究皂苷對(duì)體外發(fā)酵以及菌群的影響具有現(xiàn)實(shí)意義。

4 小結(jié)

SSA提高了體外發(fā)酵的GP和DMD，并提高了發(fā)酵液中TVFA的濃度，也相應(yīng)改變了其中的菌群相對(duì)含量，但并沒有改變瘤胃發(fā)酵模式。SSA可能通過促進(jìn)發(fā)酵液中的細(xì)菌生長，從而提高了TVFA和GP，調(diào)控瘤胃的發(fā)酵。因此，SSA可以優(yōu)化菌群，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。

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Effects of saikosaponin oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity

PAN Long1**, NIU Jun-Li1**, BU Deng-Pan1,2,3*, DU Hong1, CHENG Jian-Bo1, SUN Xian-Zhi1,WANG Xiu-Min4, QIN Jun-Jie4, YUAN Yao-Ming5, ZHANG Xing-Kai5

1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.WordAgroforestryCenter,EastandCentralAsia,Beijing100193,China; 3.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition,NortheastAgriculturalUniversity,Haerbin150030,China; 4.BeijingCentreBiologyCo.,Ltd.,Beijing102206,China; 5.ShanghaiBrightHostanCo.,Ltd.,Shanghai200436,China

An experiment was conducted to investigate the effects of saikosaponin (SSA) oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity. Four treatments consisting of supplemental SSA at 0, 0.25, 0.5, and 1.0 g/kg dry matter (DM) were combined with 0.5 g total mixed ration (TMR), 50 mL basal media and 25 mL rumen fluid obtained from ruminally cannulated, lactating Holstein dairy cows. The treatments were randomly assigned to 5 of 20 incubation bottles. Cumulative gas production (GP) was continuously monitored by an automated trace gas recording system (AGRS-III, Beijing) at 39℃ during the 48 h incubation. Relative content of the bacterial community in theinvitroculture fluid was analyzed by real-time quantitative PCR. The results revealed that SSA at 0.25 g/kg could increase dry matter degradability (DMD,P=0.08), total gas production (GP,P<0.05) and the concentration of acetate, propionate and total volatile fatty acids (TVFA) (P<0.05). Adding SSA at 0.5 and 1.0 g/kg level did not affect GP kinetics and DMD, while it increased the concentration of acetate and TVFA (P<0.05). The supplement of SSA increased the relative quantity ofRuminococcusalbusandStreptococcusbovis(P<0.05), but decreased the content ofPrevotellabrevisandRuminobacteramylophilus(P<0.05). Therefore, SSA supplementation improved gas production, increased VFA concentrations and the quantity of major microbial species in theinvitroculture fluid, which indicates that SSA may be beneficial for the manipulation of rumen microbial fermentationinvitro.

saikosaponin;invitrofermentation; bacterial quantity

10.11686/cyxb2014213

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-04-25；改回日期：2014-12-01

“十二五”科技支撐計(jì)劃(2012BAD12B02-5)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)和動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題(2004DA125184G1103)資助。

潘龍(1988-)，男，江蘇徐州人，在讀碩士。E-mail:panlong8809@163.com。?？←?1990-)，女，新疆塔城人，在讀碩士。E-mail:niujunliwxy@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work. *通訊作者Corresponding author. E-mail: burdenpan@gmail.com

潘龍, ?？←? 卜登攀, 杜洪, 程建波, 孫先枝, 王秀敏, 秦俊杰, 袁耀明, 張幸開. 柴胡皂苷對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)及細(xì)菌數(shù)量變化的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(6): 85-91.

Pan L, Niu J L, Bu D P, Du H, Cheng J B, Sun X Z, Wang X M, Qin J J, Yuan Y M, Zhang X K. Effects of saikosaponin oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 85-91.