劉 暢， 戎利民， 劉 斌

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510630)

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Sox2誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)干細(xì)胞*

劉 暢， 戎利民， 劉 斌△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討Sox2誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts， MEFs)直接重編程為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(induced neural stem cells， iNSCs)作為種子細(xì)胞治療脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法: 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Sox2轉(zhuǎn)錄因子的MEFs在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)10 d。隨后，懸浮、貼壁反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)3次。Real-time PCR檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因和多潛能標(biāo)志基因的表達(dá)。iNSCs在分化培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)7～14 d，免疫熒光分別檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表達(dá)。將iNSCs顯微注射至小鼠大腦皮質(zhì)，7～14 d后免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表達(dá)。結(jié)果: Real-time PCR顯示iNSCs的多種神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表達(dá)較誘導(dǎo)前顯著增高(P<0.05)，且iNSCs不表達(dá)多潛能相關(guān)基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫熒光顯示iNSCs高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin。免疫熒光同時(shí)表明iNSCs可在體內(nèi)外存活并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論: Sox2可以誘導(dǎo)MEFs直接重編程為神經(jīng)干細(xì)胞。iNSCs具有自我更新的能力，且在體內(nèi)外都具有三向分化潛能，可作為修復(fù)SCI合適的種子細(xì)胞。

Sox2； 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞； 直接重編程； 神經(jīng)干細(xì)胞

2006年，Takahashi等[1]首次實(shí)現(xiàn)將小鼠和人的體細(xì)胞直接重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。隨后數(shù)年，學(xué)者們進(jìn)一步改進(jìn)了誘導(dǎo)方法并提高了誘導(dǎo)效率。包括肌萎縮側(cè)索硬化癥[2]、脊髓性肌萎縮[3]和帕金森氏病[4]等多種疾病特異性的iPSCs細(xì)胞系也成功建立。這些細(xì)胞系為相應(yīng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了極大的便利，并為未來(lái)細(xì)胞移植治療提供了一種新的可能。但是，iPSCs誘導(dǎo)成為所需細(xì)胞的過(guò)程仍復(fù)雜漫長(zhǎng)。并且，與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)相似，iPSCs在體內(nèi)存在致瘤性的潛在危險(xiǎn)[5]。因此，把體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為所需細(xì)胞的直接重編程技術(shù)無(wú)疑是一種更為便捷和安全的方法。

直接重編程就是一種終末分化的體細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子的作用下直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硗庖环N終末分化的細(xì)胞。近年來(lái)，多項(xiàng)研究報(bào)道在不同組合的轉(zhuǎn)錄因子作用下，成纖維細(xì)胞可以直接重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞(induced neural cells, iNCs)[6-9]。iNCs表現(xiàn)出與神經(jīng)元相似的表型和電生理特征，其誘導(dǎo)效率可以達(dá)到5%～20%。然而，iNCs作為終末分化細(xì)胞不具備自我增殖的能力，這嚴(yán)重限制了iNCs的進(jìn)一步應(yīng)用。隨后不久，又有研究發(fā)現(xiàn)，在3種或者4種轉(zhuǎn)錄因子的作用下，小鼠成纖維細(xì)胞可以誘導(dǎo)成為具有自我更新和分化能力的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(induced neural stem cells, iNSCs)[10-11]。iNSCs是治療脊髓損傷理想的種子細(xì)胞。本研究中，我們僅僅使用一種轉(zhuǎn)錄因子Sox2成功誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)直接重編程為具有自我更新能力和多分化潛能的iNSCs。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

孕13.5 d的CD-1小鼠及8～12周CD-1小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；pMX-Sox2(獲贈(zèng)于干細(xì)胞與組織工程研究中心)； iPS細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)、N2添加物(N2 supplement)、B27添加物(B27 supplement)、DMEM/F12培養(yǎng)基、含有EDTA的胰酶、明膠溶液、維甲酸(retinoic acid，RA)購(gòu)于Sigma；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)購(gòu)自Peprotech；兔抗小鼠巢蛋白(nestin)單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白 2(microtubule-associated protein 2，MAP2)單克隆抗體購(gòu)自Millipore；兔抗小鼠膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體和兔抗小鼠髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；Triton X-100 穿膜劑購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液購(gòu)自Biosharp; 染核試劑Hoechst 33342購(gòu)自廣州齊云生物公司；甲醇和磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline solution，PBS)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

2 主要方法

2.1 培養(yǎng)基配制 MEF和Plat-E培養(yǎng)基: DMEM 高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清；誘導(dǎo)和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基: DMEM/F12 培養(yǎng)基、2 mmol/L GlutaMAX、2% B27 supplement；神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基: DMEM/F12 培養(yǎng)基、5% 胎牛血清和1 μmol/L RA。

2.2 MEFs和wt-NSCs的提取 頸椎脫臼法處死孕13.5 d的CD-1小鼠。取出胚胎，去除內(nèi)臟和四肢。保留頭部提取wt-NSCs，軀干部位提取MEFs。將相應(yīng)組織剪碎，0.25%胰酶(含EDTA)室溫下消化30 min，用巴氏吸管反復(fù)吹打1 min，加入等體積MEFs培養(yǎng)基終止消化。200×g離心5 min，分別培養(yǎng)于MEFs培養(yǎng)基和NSCs培養(yǎng)基。

2.3 Sox2逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝 提前1 d將Plat-E細(xì)胞鋪板，次日細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Lipo 2000和pMX-Sox2質(zhì)粒在Opti-MEM培養(yǎng)基中共同孵育20 min，加入無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染Plat-E細(xì)胞6～8 h。48 h和72 h分別收取病毒上清液，0.45 μm濾器過(guò)濾。過(guò)濾后的病毒液與新鮮MEF培養(yǎng)基1∶1混合后感染MEFs。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEFs 使用P2～P4代的MEFs作為誘導(dǎo)起始細(xì)胞。提前 1 d將MEFs種植在明膠包被的玻璃蓋玻片上，第2天和第 3天重復(fù)加入Sox2逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染細(xì)胞。隨后，感染后的MEFs用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 Real-time PCR檢測(cè) 無(wú)菌PBS洗3遍，常規(guī)Trizol法提取總RNA。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各標(biāo)記物基因引物見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)條件如下：50 °C 2 min，95 °C 10 min；95 °C 15 s，60 °C 30 s，72 °C 36 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；95 °C 15 s，60 °C 1 min。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

表1 引物序列

2.6 免疫熒光染色 PBS清洗3遍，每次5 min，加入兔抗小鼠nestinⅠ抗(1∶200)、MAP-2Ⅰ抗(1∶1 000)、GFAPⅠ抗(1∶200)及MBPⅠ抗(1∶200)，4 °C環(huán)境中孵育過(guò)夜；第2 天吸除Ⅰ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，加入羊抗兔熒光標(biāo)記Ⅱ抗(1∶50)或驢抗兔熒光標(biāo)記Ⅱ抗(1∶ 400)，室溫孵育1 h；吸除Ⅱ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，Hoechst 33342染核2～3 min；吸除染核試劑，添加少量PBS后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

2.7 iNSCs的分化 iNSCs懸浮培養(yǎng)7 d聚集成球后接種于明膠包被的培養(yǎng)皿中。次日換用含有血清和維甲酸的培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化。繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d，行免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。

2.8 iNSCs移植到小鼠大腦皮質(zhì) 10%水合氯醛腹腔注射6～8周CD-1小鼠(200 mg/kg)，麻醉后用安爾碘消毒皮膚。沿小鼠頭部正中線切開(kāi)皮膚，暴露顱骨，顯露矢狀縫、冠狀縫、前囟。于前囟前1 mm、正中線右側(cè)2.5 mm處，用1 mm顱鉆開(kāi)孔，然后將50 μL微量注射器經(jīng)骨孔垂直進(jìn)入3.5 mm，緩慢注入GFP標(biāo)記的iNSCs懸液。注射完畢后，針頭停留15 min，緩慢拔針?？p合皮膚，待其自然蘇醒。7 d后處死取材，行免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析。以P<0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞

感染前的MEFs呈長(zhǎng)梭形(圖1A)，感染后第6天，可以看到MEFs形態(tài)發(fā)生明顯變化。細(xì)胞呈現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)，且各克隆間有相互聯(lián)系(圖1B)。免疫熒光結(jié)果顯示感染后的細(xì)胞Sox2和nestin染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。

感染后10 d，消化收集細(xì)胞后進(jìn)一步培養(yǎng)和擴(kuò)增。為了純化NSC樣細(xì)胞，我們把細(xì)胞種植在低吸附培養(yǎng)皿中。3～4 d后，可以看到神經(jīng)球樣克隆形成(圖1C)。把神經(jīng)球樣克隆貼壁培養(yǎng)后可以觀察到神經(jīng)突起樣結(jié)構(gòu)從克隆邊緣爬出(圖1D)。為了進(jìn)一步純化和擴(kuò)增NSC樣細(xì)胞，我們把克隆反復(fù)懸浮和貼壁培養(yǎng)2～3次。如圖3所示，第8代和20代NSC樣細(xì)胞與野生型NSCs形態(tài)高度相似。

Figure 1.Induction of iNSCs. A: the morphology of MEFs before infection； B: 6 d after infection, the morphology of MEFs was dramatically changed; C: iNSCs formed neurosphere in suspension culture; D: cultured 2 d on gelatin-coated dish.Scale bar=200 μm.

Figure 2.NSC markers were assessed by immunofluorescence, including Sox2 and nestin. Scale bar=100 μm.

2 Real-time PCR鑒定iNSCs

MEFs直接重編程的iNSCs表達(dá)多種NSC標(biāo)志基因，包括nestin、Pax6、zbtb16和Blbp，表達(dá)水平較未感染的MEFs組明顯增高(P<0.05)。另外，與iPSCs相比，iNSCs不表達(dá)多潛能相關(guān)基因如Oct4、Nanog和Zfp42(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

Figure 4.The expression of NSC markers in iNSCs was significantly increased compared with MEFs. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs MEFs.

Figure 5.The iNSCs did not express pluripotency-related genes. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs iPSCs.

3 iNSCs在體外具有多分化潛能

在NSC分化培養(yǎng)基(去除生長(zhǎng)因子的NSC培養(yǎng)基)中貼壁培養(yǎng)iNSCs。1周后，可見(jiàn)貼壁的神經(jīng)球周?chē)猩窠?jīng)元爬出(圖6)。免疫熒光顯示有不成熟神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元Ⅲ類(lèi)β微管蛋白(neuronal class Ⅲ β-tubulin，Tuj1)染色陽(yáng)性(圖7A)。培養(yǎng)2周，可以觀察到成熟神經(jīng)元(MAP2)染色陽(yáng)性(圖7B)。另外，與wt-NSCs相似，iNSCs也具有分化星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。在特定的培養(yǎng)條件下，7～20 d可以觀察到GFAP和MBP染色陽(yáng)性(圖7C、D)。因此，iNSCs具有多分化潛能，可以分化為神經(jīng)元和多種膠質(zhì)細(xì)胞。

Figure 6.Neurites and neuron-like cells were observed under microscopic observation after neurosphere adherence.

4 iNSCs可以在體內(nèi)存活和分化

小鼠大腦冰凍切片免疫熒光顯示，細(xì)胞注射7 d后，可見(jiàn)GFP標(biāo)記的nestin染色陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞和MAP2染色陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞。除此之外，還可以觀察到GFAP、MBP染色陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。這說(shuō)明iNSCs可以在體內(nèi)存活且具有多分化潛能，見(jiàn)圖8。

討 論

體細(xì)胞直接重編程為具有自我增殖和分化能力的iNSCs對(duì)于再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著重大的意義。它可以作為疾病研究的模型來(lái)揭示發(fā)病機(jī)制，可以用于藥物篩選和毒性試驗(yàn)，同樣還可以作為移植治療的種子細(xì)胞[12]。近幾年，很多關(guān)于NSCs的研究都把重點(diǎn)放在從ESCs和iPSCs分化獲得NSCs。然而倫理學(xué)問(wèn)題和實(shí)際應(yīng)用難度大的短板如ESCs的來(lái)源問(wèn)題和iPSCs的致瘤性[1]始終阻礙了這些方法的發(fā)展[13]。利用直接重編程技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iNSCs是近幾年興起的新技術(shù)。該方法很好地規(guī)避了iPSCs潛在致瘤性的危險(xiǎn)，也比ESCs更容易取材和操作且不會(huì)涉及倫理道德問(wèn)題。直接重編程是取代以上2種方法一個(gè)更好的選擇。

Figure 7.Immunofluorescence staining of differentiated iNSCs in vitro. Neurons, oligodendrocytes and astrocytes were assessed by immunofluorescence for Tuj1 (A), MAP2 (B), GFAP (C) and MBP (D). Scale bar=200 μm.

近幾年，有多篇研究報(bào)道了體細(xì)胞可以直接重編程為iNSCs，不同組合的轉(zhuǎn)錄因子被用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接重編程為iNSCs。相比其它學(xué)者使用多種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)直接再編程的發(fā)生，本研究?jī)H僅使用了一種轉(zhuǎn)錄因子Sox2就成功誘導(dǎo)得到iNSCs。使用更少的轉(zhuǎn)錄因子其潛在風(fēng)險(xiǎn)就更小，例如，c-myc是一種原癌基因，且被認(rèn)為是iPSCs引起畸胎瘤的主要原因。本研究使用的單因子誘導(dǎo)方法更加有利于iN-SCs在未來(lái)更為安全地應(yīng)用于臨床。

Figure 8.Immunofluorescence staining of iNSCs and differentiated iNSCs in vivo (×200). Neural stem cells, neurons, oligodendrocytes and astrocytes were assessed by immunofluorescence for nestin (A), MAP2 (B), GFAP (C) and MBP (D).

通過(guò)直接重編程技術(shù)，成纖維細(xì)胞可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞[8-9]。但是，這些終末分化的細(xì)胞并不具備干細(xì)胞的特性。它們不能高效率的增殖和分化。因此，它很難為未來(lái)的細(xì)胞移植治療提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。這將嚴(yán)重限制其應(yīng)用。除此之外，iNCs的細(xì)胞表型太過(guò)單一，它只表現(xiàn)出神經(jīng)元或者膠質(zhì)細(xì)胞的特性[7]。然而，神經(jīng)系統(tǒng)功能的修復(fù)往往需要多樣化神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的共同作用。iNSCs的成功誘導(dǎo)很好地克服了iNCs不能增殖和表型單一的缺點(diǎn)。它具有干細(xì)胞特性和多分化潛能。iNSCs可以提供足夠的細(xì)胞量和豐富的細(xì)胞表型。本研究誘導(dǎo)得到iNSCs可以在體內(nèi)外增殖且具有多分化潛能。

iNSCs是細(xì)胞移植治療很好的種子細(xì)胞。然而，要想把iNSCs在最佳治療窗期間應(yīng)用于病人，需要繼續(xù)去探索更多且更有效的提高轉(zhuǎn)化效率的方法[14]，足夠高的轉(zhuǎn)化效率將是未來(lái)學(xué)者們努力的一大目標(biāo)。另外，直接重編程中的另外一個(gè)不可忽視的問(wèn)題是外源基因與細(xì)胞基因組的整合問(wèn)題。無(wú)一例外，目前任何一種直接重編程的方法都用到了不同的轉(zhuǎn)錄因子和病毒載體[10]，其中，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒是目前應(yīng)用最廣泛的載體。病毒載體與細(xì)胞的整合也可能會(huì)帶來(lái)一些難以預(yù)料的后果。不同程度基因插入和染色體整合也可能會(huì)給宿主帶來(lái)不利的影響。因此，需要尋找更好的方法去替代病毒載體轉(zhuǎn)染等方法，那么就有可能建立更加安全、有效、標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)化體系。也將更加有利于iNSCs早日成功應(yīng)用于臨床。

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Sox2 induce mouse embryonic fibroblasts direct reprogramming into neural stem cells

LIU Chang, RONG Li-min, LIU Bin

(DepartmentofSpineSurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:johnliu2001@sina.com)

AIM: To study the direct reprogramming method of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) converted into induced neural stem cells (iNSCs). METHODS: Sox2-infected MEFs were cultured in NSCs culture medium for 10 d. Subsequently, repeated suspension and adherent culture were performed for 3 times for the purification of iNSCs. The iNSCs were cultured in suspension medium. Real-time PCR was used to detect the expression of neural stem cell marker genes and pluripotent marker gene.Invivo, iNSCs were microinjected into the mouse cerebral cortex. Immunofluorescence was performed to detect the expression of neural stem cell, neuron, oligodendrocyte and astrocyte markersinvitroandvivo. RESULTS: A variety of neural stem cell marker gene expression was significantly increased in iNSCs detected by real-time PCR. Immunofluorescence confirmed that iNSCs expressed nestin and differentiated into neurons, oligodendrocytes and astrocytesinvitroandvivo. CONCLUSION: Sox2 is sufficient to trigger the direct reprogramming from MEFs to iNSCs. iNSCs have the ability of self-renew and 3 differentiation potentialsinvivoandvitro. iNSCs are the suitable seed cells of SCI.

Sox2; Mouse embryonic fibroblasts; Direct reprogramming; Neural stem cells

1000- 4718(2015)01- 0087- 06

2014- 07- 14

2014- 11- 10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31170947； No. 31470949； No. 81472122)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2012020011099； No. S2013010016413)； 廣東省科技計(jì)劃(No. 2012B060300008)； 教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目(No. 20100171120088)； 廣州市科技計(jì)劃(No. 2013J4100062)

△通訊作者 Tel: 020-85252900; E-mail: johnliu2001@sina.com

Q813.5； R318

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.017