郭妍君，田 蕾，申 健，韓誠武，戚曉利

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

0 引 言

農(nóng)桿菌介導(dǎo)是目前研究轉(zhuǎn)基因植物采用的主要方法，高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系對于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化和功能基因組學(xué)研究具有重要意義［1］.本課題組承擔(dān)了國家科研院所公益基金合作項(xiàng)目，以高耐鹽胡楊為試驗(yàn)材料，采用可轉(zhuǎn)化人工染色體庫技術(shù)，將胡楊DNA 大片段轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，以構(gòu)建擬南芥的轉(zhuǎn)化子庫，篩選具有潛在育種價值的功能基因，為進(jìn)一步通過分子育種方法培育新品種提供理論基礎(chǔ)和基因資源.由于BIBAC 文庫插入的外源基因片段大，構(gòu)建轉(zhuǎn)化子庫的工作量繁重，提高轉(zhuǎn)化效率、簡化轉(zhuǎn)化工作尤為重要.

1 試驗(yàn)的材料和方法

1.1 擬南芥的種植

擬南芥種子(Columbia)4℃春化2－4d，播種于培養(yǎng)缽(直徑10cm)基質(zhì)表面，每盆播5－6 點(diǎn)，培養(yǎng)基質(zhì)為草炭土和蛭石(7:3)混合.覆蓋塑料薄膜，置于培養(yǎng)室生長(溫度22±2℃，16h 光/8h 暗培養(yǎng)).待花序長出10cm 高時，從主莖基部剪掉花序，當(dāng)側(cè)生花序長出并基部的花剛剛盛開時進(jìn)行轉(zhuǎn)化.

1.2 花浸法(Floral Dip)轉(zhuǎn)化擬南芥

載有胡楊大片段DNA 的根癌農(nóng)桿菌GV3101由中國林業(yè)科學(xué)研究院提供.將菌液在LB 固體培養(yǎng)基(15mg/l Rif*50mg/lkm)上劃線培養(yǎng).挑取單克隆在LB 液體培養(yǎng)基(15mg/l Rif*50mg/lkm)中28℃搖菌培養(yǎng)1－2 d，待農(nóng)桿菌生長至OD=1.0左右時離心富集菌體，分別懸浮于含有0，0.05%，0.10%，0.20%，0.25%的Silwet L－77 和5%蔗糖與1/2MS 培養(yǎng)基溶液或5%蔗糖與無菌H2O 溶液中，調(diào)OD 值至0.8－1.0 作為滲透液.

按照Clough 方法［2］，選取花期健壯植株，將花序浸泡于滲透液中，浸泡時間分別為浸染1min 隔周后再次浸染或浸染5min 浸染一次.取出后覆保鮮膜暗處橫放于塑料盤中16－24h，取出正常培養(yǎng).收獲種子干燥備用.

1.3 轉(zhuǎn)化植株篩選

收獲種子用70%的乙醇1mL 消毒30min，無水乙醇1mL 洗2 次，放在超凈臺滅菌濾紙上晾干.均勻撒到固體篩選培養(yǎng)基(MS，3%蔗糖，pH 5.8，0.8%瓊脂，50mg/lkm)表面上，4℃春化2 d，培養(yǎng)室培養(yǎng).1－2 周后將綠色植株轉(zhuǎn)入土壤中繼續(xù)生長，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化株數(shù).

2 結(jié)果和討論

2.1 農(nóng)桿菌活化

2.1.1 農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)情況

對含有胡楊DNA 大片段的農(nóng)桿菌進(jìn)行劃線培養(yǎng)以獲得單菌落，試驗(yàn)統(tǒng)計了100 個菌種系號，劃線結(jié)果顯示71 個系號成功獲得單菌落，失敗29個，劃線成功率為71%.表明一部分農(nóng)桿菌因反復(fù)凍融、運(yùn)輸、保存等原因?qū)е峦庠促|(zhì)粒丟失.因此，菌種郵寄盡量選擇冬季氣溫低時進(jìn)行;收到菌種后及時分裝，一部分保存在－80℃，一部分保存在－20℃用于劃線培養(yǎng);操作時菌種嚴(yán)格冰上存放，動作迅速，減少融化的時間及次數(shù).

2.1.2 農(nóng)桿菌搖菌情況

挑取農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行搖菌，試驗(yàn)統(tǒng)計了50個菌號，失敗5 個，搖菌成功率為90%.同批次的菌生長速率不同(見圖1a)，異常生長出現(xiàn)如豆渣狀沉淀(圖1b)、球狀物等(圖1c).YEP 培養(yǎng)基替換LB 培養(yǎng)基后仍出現(xiàn)同樣現(xiàn)象.BIBAC 文庫插入的外源基因片段大導(dǎo)致生長速率不一致，影響到農(nóng)桿菌細(xì)胞的生長.解決辦法是充分預(yù)搖，挑取單克隆接種于5mLLB(含15mg/l Rif*50mg/l km)中28℃搖菌培養(yǎng)1－2d，至混濁再按1:50 加新鮮LB擴(kuò)大培養(yǎng).同時降低接種量，減少搖菌時間，使用新鮮LB 培養(yǎng)液可減少圖1b、c 情況的出現(xiàn).

圖1 不同克隆農(nóng)桿菌在液態(tài)培養(yǎng)基生長情況

2.2 轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

2.2.1 表面活性劑Silwet－L 77 濃度對浸染效率的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中，表面活性劑可以通過減小表面張力增加農(nóng)桿菌在受體細(xì)胞上的吸附，提高細(xì)胞膜的通透性而增加T－DNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，但濃度太高則引起組織壞死［3，4］.試驗(yàn)比較了5個不同濃度Silwet－L 77 對浸染效率的影響(見圖2)，選擇5 個克隆號浸染50 株擬南芥，Silwet L－77 的濃度為0.20%時，得到最多的陽性植株.

圖2 不同濃度Silwet－L 77 浸染效率

2.2.2 擬南芥浸染懸浮液的成分對轉(zhuǎn)化效率的影響

試驗(yàn)比較了2 種懸浮液的成分對浸染效率的影響(見圖3)，用1/2MS 液體培養(yǎng)基和用無菌水作為懸浮液組分得到的陽性植株僅差6 株，統(tǒng)計學(xué)分析(t 檢驗(yàn))P ＞0.05，差異不顯著.因此用無菌水代替1/2 作為懸浮液組分不影響轉(zhuǎn)化效率，卻可很大程度的簡化擬南芥浸染工作.

圖3 不同懸浮液成分對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.2.3 擬南芥浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

浸染時間與擬南芥植株健壯程度有關(guān).浸染時間通常情況下浸染1 min，一周后進(jìn)行二次浸染(方案1).尚愛華等［5］對胡楊大片段DNA 轉(zhuǎn)化效率研究表明滲透液的最適侵染時間40 s 左右，同一株植株浸染三次的轉(zhuǎn)化率較高.而東北地區(qū)冬季漫長，室內(nèi)氣溫低擬南芥生長健壯［6］，植株浸染5 min 后沒有出現(xiàn)生長受阻現(xiàn)象，因此實(shí)驗(yàn)比較了浸染5min 浸染1 次(方案2)的轉(zhuǎn)化效率.試驗(yàn)結(jié)果見表1，方案2 篩選出的陽性苗數(shù)量明顯多于方案1.胡楊BIBAC 文庫的克隆數(shù)多，建立擬南芥轉(zhuǎn)化子庫工作量大，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明可以通過延長浸染時間，減少侵染次數(shù)提高轉(zhuǎn)化工作效率，從而減少工作量.

表1 浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

3 結(jié) 論

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用Florial dip 法轉(zhuǎn)化擬南芥的方法既簡單且轉(zhuǎn)化率高，有利于大規(guī)模構(gòu)建突變體庫及轉(zhuǎn)化子庫.但對大片段DNA 轉(zhuǎn)化的效率依舊很低，亟待建立高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，加快利用基因工程途徑對植物遺傳修飾的步伐.本研究中轉(zhuǎn)化的胡楊BIBAC 克隆，其中轉(zhuǎn)化擬南芥共計3687 個BIBAC 克隆，1160 個克隆成功得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥，只有31.46%的轉(zhuǎn)化成功效率.很大原因是由于BIBAC 文庫插入的外源基因片段大，很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化.可通過改善轉(zhuǎn)化條件來增加轉(zhuǎn)化效率，一是減少農(nóng)桿菌反復(fù)凍融的次數(shù)，提高農(nóng)桿菌的質(zhì)量和減少質(zhì)粒片段的缺失;二是改善轉(zhuǎn)化浸染條件來提高擬南芥轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明滲透劑Silwet L－77 濃度為0.20%、蔗糖5%、無菌水替代1/2MS做懸浮液、浸染5min、浸染一次轉(zhuǎn)化效率最高.

［1］ 葉興國，王新敏，王軻，等.提高植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率輔助策略研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(15):3007－3019.

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［5］ 尚愛華，楊雪芹，等.利用花序浸泡法將大片段胡楊基因轉(zhuǎn)入擬南芥［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2013，8:78－80.

［6］ 戚曉利，趙樹堂，韓誠武.東北地區(qū)擬南芥室內(nèi)栽培技術(shù)［J］.中國野生植物資源，2014，33(5):64－66.