朱振標(biāo)，林之斌，丁曉莉，劉亦恒

(?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及MAPK信號通路的影響

朱振標(biāo)，林之斌，丁曉莉，劉亦恒

(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

目的 觀察骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/骨保護素(OPG)表達及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的影響。方法選用雌性大鼠45只，分為假手術(shù)組(15只)和手術(shù)組(30只)，手術(shù)組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，造模12周時測定BMD，確認OP復(fù)制成功后，將手術(shù)組大鼠又隨機分為模型組和骨碎補總黃酮給藥組，每組均15只；給藥組大鼠給予骨碎補總黃酮灌胃，持續(xù)時間為12周，模型組和假手術(shù)組同時給予等量生理鹽水灌胃；實驗結(jié)束后測定大鼠的BMD，ELISA法檢測大鼠血清RANKL、OPG含量，RT-PCR檢測大鼠骨組織RANKL、OPG mRNA表達，Western blot法檢測骨組織c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38MAPK(p38)、細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平及c-Fos表達。結(jié)果干預(yù)治療12周后：(1)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左、右股骨BMD降低(P＜0.05)，血清RANKL含量增加、OPG含量降低、RANKL-OPG比值增大(P均＜0.05)，骨組織RANKL mRNA表達增加、OPGmRNA表達減少(P均＜0.05)。(2)與模型組比較，假手術(shù)組和骨碎補總黃酮治療組左、右股骨BMD均增加(P均＜0.05)，血清RANKL含量降低、OPG含量增加、RANKL-OPG比值減小(P均＜0.05)，骨組織RANKL mRNA表達減少、OPG mRNA表達增加(P均＜0.05)，且假手術(shù)組和骨碎補總黃酮治療組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(3)與模型組比較，假手術(shù)組和骨碎補總黃酮治療組大鼠骨組織P-JNK、c-Fos表達降低(P均＜0.05)，但這兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論骨碎補總黃酮可增加去卵巢大鼠骨密度，其途徑可能是通過調(diào)節(jié)RANKL-OPG平衡、抑制JNK磷酸化及c-Fos表達實現(xiàn)的。

骨碎補總黃酮；骨質(zhì)疏松；MAPK信號通路

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是以低骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性代謝性破壞性骨疾病，其臨床上常伴有骨脆性增加、骨強度降低，易發(fā)生骨折[1]，是常見的老年性疾病之一，近幾年由于社會的發(fā)展和人口的老齡化，OP的發(fā)病率逐年上升，據(jù)我國流行病學(xué)調(diào)查報告，骨質(zhì)疏松癥50~60歲發(fā)病率為21%，60~70歲發(fā)病率為58%，70~80歲發(fā)病率為100%。尤其是絕經(jīng)后婦女，由于絕經(jīng)后雌激素水平降低導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和骨折并發(fā)癥發(fā)病率遠遠高于男性[2]。防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要方法是雌激素替代療法，但臨床中發(fā)現(xiàn)其容易引起癌變及其他的副作用。近年來，國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注一組來源于植物，被命名為植物雌激素，在人體內(nèi)具有雌激素樣作用的化合物，這些化合物主要包括金雀異黃素、骨碎補總黃酮、葛根異黃酮、丹參酮等。這一類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素非常相似，其可發(fā)揮擬雌激素或抗激素效應(yīng)。骨碎補總黃酮(Total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)是骨碎補的主要有效成分，其具有類似于植物雌激素的作用，而且毒副作用低微，可作為雌激素的替代品長期服用，避免了雌激素的致癌作用，值得深入研究探討。為了研究骨碎補總黃酮治療OP的作用機制，本次實驗觀察了骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的影響，探討骨碎補總黃酮防治OP的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用6個月齡清潔級、SD大鼠，45只，雌性，體重為180 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(湘)2009-0012]。

1.2 主要試劑及儀器 TFRD(北京歧黃制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字220030008，批號：090601。每1 g提取物相當(dāng)于生藥66.7 g)；大鼠血清核因子κB受體活化因子配體(RANKL)；兔抗大鼠翼式轉(zhuǎn)錄因子氨基末端激酶(JNK)；BCA-100蛋白定量檢測試劑盒(由上海申能博彩生物科技有限公司提供)；磷酸化的JNK(P-JNK)、細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、SYBRROPremix Ex TaqTM熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自大連寶生物有限公司)；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)、磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化的Pp絲裂原活化蛋白激酶(P-p38)、c-Fos、兔抗大鼠GAPDH抗體、骨保護素(OPG)ELISA檢測試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗分組 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用自來水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按隨機數(shù)字表法將45只大鼠隨機分為假手術(shù)組15只、手術(shù)組30只。假手術(shù)組大鼠行腹腔手術(shù)找到卵巢，但不切除，手術(shù)組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。所有動物飼養(yǎng)12周后檢測BMD，以確定OP動物模型復(fù)制成功是否，若成功后即將30只手術(shù)組大鼠再隨機分為模型組15只、骨碎補總黃酮給藥組15只。

1.4 制作OP模型 OP模型制做參照文獻中的方法[3-4]，切除雙側(cè)卵巢制作大鼠OP模型。將稱重后的各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，行全身麻醉后取仰臥位，固定后進行腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白線作縱行切口(切口長度2~3 cm)，打開腹腔后即切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后切口用75%酒精棉球消毒。假手術(shù)組亦打開腹腔，但不切除卵巢。術(shù)后為預(yù)防感染各組大鼠腹腔注射10萬單位青霉素，3 ml/只，1次/d，連續(xù)3 d。術(shù)后第12周，手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠行全身麻醉后應(yīng)用雙能X線骨密度儀測定左右股骨BMD。

1.5 給藥方法及標(biāo)本采集 模型復(fù)制成功后，給藥組大鼠用骨碎補總異黃酮灌胃(50 mg/kg)。將藥物稀釋成1.0 ml/100 g體重(5 mg/ml)后即進行灌胃，1次/d(灌胃前12 h應(yīng)禁食不禁水，持續(xù)12周)。同時假手術(shù)組和模型組用等量生理鹽水灌胃。灌胃12周后處死大鼠，腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，心臟采血，離心后取血清，置-20℃?zhèn)溆?。再依次灌注生理鹽水(200~250 ml)、4%多聚甲醛(350~400 ml)。灌注完以上液體即取左側(cè)股骨，截取左下肢1 cm骨組織，用DEPC水處理后，密封包裹保存于液氮中；取出右側(cè)股骨，在4℃條件下用4%多聚甲醛固定24 h。

1.6 大鼠血清RANKL、OPG含量檢測 血清RANKL、OPG含量測定采用ELISA法，按試劑盒說明書進行操作。

1.7 大鼠骨組織RANKL、OPG mRNA表達檢測 引物的設(shè)計以管家基因(GAPDH)為對照，大連寶生物有限公司合成，RT-PCR方法見參考文獻[5]，見表1。

表1 PCR中應(yīng)用的引物序列

1.8 大鼠骨組織P-JNK、P-P38、P-ERK、c-Fos蛋白表達 將上述左下肢骨組織充分勻漿后加入0.5 ml RIPA裂解液后提取蛋白，用Western blot法測定蛋白表達，上樣，電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜1 h后進行如下操作，先加一抗，室溫下孵育過夜，再加二抗，室溫下孵育，后化學(xué)發(fā)光、成像分析系統(tǒng)曝光。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左、右股骨BMD變化 手術(shù)12周后，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠左、右股骨BMD值降低(P＜0.05)，這說明手術(shù)組大鼠的骨量明顯丟失，同時提示OP模型復(fù)制成功，見表2。

表2 手術(shù)12周時兩組大鼠左股骨、右股骨BMD值結(jié)果比較(±s，g/cm2)

表2 手術(shù)12周時兩組大鼠左股骨、右股骨BMD值結(jié)果比較(±s，g/cm2)

15 15手術(shù)組假手術(shù)組t值P值0.212±0.009 0.289±0.007 -26.156＜0.001 0.228±0.002 0.282±0.006 -33.068＜0.001

2.2 各組大鼠血清RANKL、OPG含量變化 給藥結(jié)束后，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠骨組織RANKL含量增加(P＜0.05)，而OPG含量減少(P＜0.05)，RANKL/OPG比值明顯增大(P＜0.05)；與模型組比較，骨碎補總黃酮給藥組大鼠骨組織RANKL含量減少(P＜0.05)，而OPG含量增加(P＜0.05)，RANKL/ OPG比值亦減小(P＜0.05)，見表3。

2.3 各組大鼠骨組織RANKL、OPG mRNA表達變化 RT-PCR檢測表明，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組及骨碎補總黃酮給藥組大鼠骨組織RANKL mRNA的表達增加(P＜0.05)，OPG mRNA表達減少(P＜0.05)，與模型組比較，骨碎補總黃酮給藥組大鼠骨組織RANKL mRNA的表達明顯減少(P＜0.05)，而OPG mRNA表達增加(P＜0.05)，見表4。

表3 各組大鼠血清RANKL、OPG含量變化(±s)

表3 各組大鼠血清RANKL、OPG含量變化(±s)

注：a與假手術(shù)組比較，P<0.05，b與模型組比較，P<0.05.

組別模型組假手術(shù)組骨碎補總黃酮給藥組F值P值只數(shù)15 15 15 RANKL(PB：pg/ml) 81.820±1.500a15.300±0.540 25.600±1.100b15376.817＜0.001 OPG(PB：pg/ml) 241.01±10.580a381.400±10.240 365.290±11.530b759.455＜0.001 RANKL/OPG 0.340±0.010a0.042±0.001 0.072±0.009b6656.374＜0.001

表4 各組大鼠骨組織RANKL、OPG mRNA的表達(±s)

表4 各組大鼠骨組織RANKL、OPG mRNA的表達(±s)

注：a與假手術(shù)組比較，P<0.05，b與模型組比較，bP<0.05.

組別模型組假手術(shù)組骨碎補總黃酮給藥組F值P值只數(shù)15 15 15 RANKL(PB：pg/ml) 5.10±0.10a1.02±0.08 3.2±1.16b137.714＜0.001 OPG(PB：pg/ml) 1.01±0.04a0.23±0.01 0.80±0.03b2819.423＜0.001

2.4 骨碎補總黃酮對大鼠骨組織MAPK信號通路的影響 治療12周后，Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠骨組織P-JNK蛋白表達亦增加(P＜0.05)，見圖1；c-Fos蛋白表達增加(P＜0.05)，見圖2；與模型組比較，骨碎補總黃酮治療組大鼠骨組織P-JNK和c-Fos蛋白表達均減少(P＜0.05)；各組大鼠P-p38、P-ERK蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3和圖4。

圖1P-JNK蛋白表達

圖2 c-Fos蛋白表達

圖3 P-p38蛋白表達

圖4P-ERK蛋白表達

3 討論

OP的臨床表現(xiàn)主要為患者骨量明顯下降，易發(fā)骨折，同時可能還伴有嚴(yán)重的骨痛，其主要是由骨重建高轉(zhuǎn)換而引起的。骨重建的過程包括破骨細胞(OC)激活后與相耦聯(lián)的成骨細胞(OB)激活骨形成終結(jié)這兩個過程。腫瘤壞死因子超家族成員中的RANKL、核因子κB受體活化因子(RANK)和OPG通過對OC和OB之間的耦聯(lián)關(guān)系調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換的速度[6]。目前已知OC生成所必需的細胞因子是RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(M-CFS)[7]。OPG是OB譜系中各種細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，OPG的N末端與RANK結(jié)構(gòu)相似，其作用是與RANKL結(jié)合后抑制RANKL與RANK的結(jié)合，進而抑制前體OC分化、生存與活化，促進成熟OC的凋亡，阻斷信號連接[8]。骨重建中起重要調(diào)節(jié)作用的是由RANKL、RANK、OPG組成的RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)。RANKL/OPG值的變化受骨形成與骨吸收狀態(tài)的影響，OC誘導(dǎo)分化的決定性因素[9]；有研究表明阻斷RANKL與RANK結(jié)合，降低RANKL/OPG比值即可抑制OC的分化、生存與活化，從而起到防治骨質(zhì)疏松的作用[10]。

在本研究中檢測大鼠骨組織中RANKL mRNA、OPG mRNA和這兩個指標(biāo)的蛋白表達水平，與假手術(shù)組相比，均出現(xiàn)模型組大鼠OPG含量降低(P＜0.05)，而RANKL含量增高(P＜0.05)，RANKL/OPG比值升高(P＜0.05)，這是由于卵巢被切除后缺乏雌激素，出現(xiàn)OC的分化、成熟、活化，從而導(dǎo)致骨丟失加快，骨吸收增加，以致引起上述指標(biāo)的變化。骨碎補總黃酮治療12周后，血清中OPG含量增多(P＜0.05)，RANKL含量降低(P＜0.05)，RANKL/OPG比值變低(P＜0.05)，提示骨碎補總黃酮可能通過減小RANKL/ OPG的比值，抑制OC分化、成熟、活化，抑制OC的骨吸收，從而起到治療骨質(zhì)疏松的作用。

MAPK信號通路主要包括p38、ERK、JNK 3條。其中ERK通路包括ERK1和ERK2，分子量分別為44和42，因此該通路又名P42/44[11]。它是RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)向下游傳遞信號的主要途徑。研究表明RANKL與RANK結(jié)合后可進一步激活MAPK家族的信號通路(JNK、ERK、p38)，進而激活轉(zhuǎn)錄因子-活化蛋白1(AP-1)，將RANKL的信號傳遞下去[12]。AP-1的主要組成部分之一是c-Fos，c-Fos在OC分化中發(fā)揮重要的作用。

在骨碎補總黃酮治療12w后檢測大鼠骨組織MAPK家族(JNK、P38、ERK)及MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos的表達，發(fā)現(xiàn)骨組織中p-38、P-ERK水平低，P-p38/總p38無明顯改變，P-ERK/總ERK比值亦無顯著改變，說明去卵巢大鼠在骨碎補總黃酮治療12周后p38和ERK未被激活。而與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨組織P-JNK/總JNK比值增大，P-JNK水平增高(P＜0.05)，說明模型組大鼠JNK蛋白已被激活，由此說明，骨碎補總黃酮可降低P-JNK/總JNK比值(P＜0.05)。同樣，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織c-Fos蛋白表達水平增高(P＜0.05)，骨碎補總黃酮均使c-Fos的表達降低(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，骨碎補總黃酮可能通過抑制下游的轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和JNK蛋白，通過這種途徑調(diào)控OC的分化、成熟與活化。

本研究結(jié)果表明骨碎補總黃酮能提高去卵巢大鼠骨密度，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)RANKL-OPG平衡及抑制P-JNK和c-Fos表達而實現(xiàn)的，其機制值得進一步的研究探討。

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Effects of drynaria total flavonoids on RANKL/OPG balance and MAPK signaling pathways in overiectomized rats.

ZHU Zhen-biao,LIN Zhi-bing,DING Xiao-li,LIU Yi-heng.Department of Orthopaedics,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of drynaria total flavonoids on receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANKL)/Osteoprotegerin(OPG)expression and mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathways in ovariectomized rats.MethodsForty-five female rats were divided into sham operation group(15 rats)and operation group(30 rats).The rats in operation group all underwent ovariectomy and had bone mineral density(BMD)detected 12 weeks later.After confirming the success of OP,the rats in operation group were divided into drynaria total flavonoids group and model group,with 15 rats in each group.The drynaria total flavonoids group was treated with drynaria total flavonoids solution,while the model group and sham operation group received gastric perfusion of normal saline.The duration of treatment was 12 weeks.The level of BMD was checked.The expression of RANKL,OPG was detected by ELISA.The expression of RANKL and OPG mRNA of femur was detected by RT-PCR.Western blotting analysis was used to examine the phosphorylation of c-Jun Ntermingal kinase(JNK), MAPK p38,extracellular-regulated kinase ERK,and c-FOS protei expression in bone tissues.Results(1)Compared with sham operation group,after 12-week treatment,the BMD in model group were significantly lower(P＜0.05).The serum RANKL level increased significantly,serum OPG level decreased significantly,and the RANKL/OPG ratio increased significantly(allP＜0.05).The RANKL mRNA expression significantly increased and OPG mRNA decreased significantly in bone tissues(allP＜0.05).(2)Compared with model group,BMD was higher than that of rats in sham operation group and drynaria total flavonoids group(allP＜0.05).The serum RANKL level decreased significantly, and the serum OPG level increased significantly,with the RANKL/OPG ratio decreased significantly(allP＜0.05). The RANKL mRNA expression decreased significantly and OPG mRNA increased significantly in bone tissues(allP＜0.05).There were significant differences among sham operation group and drynaria total flavonoids group(P＜0.05). (3)Compared with model group,bone tissue P-JNK and c-Fos expression in rats in sham operation group and drynariatotal flavonoids group were lower,but there were no significant differences among sham operation group and drynaria total flavonoids group(P＞0.05).ConclusionDrynaria total flavonoids group can improve the BMD values in ovariectomized rats,which may be related to its function in regulating the balance of RANKL/OPG and inhibiting the expression of JNK phosphorylation and c-Fos.

Drynaria total flavonoids;Osteoporosis;MAPK signaling pathways

R-332

A

1003—6350（2015）09—1249—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0450

2014-11-12)

海南省自然科學(xué)基金（編號：811156）；海南省衛(wèi)生廳資助項目（編號：瓊衛(wèi)2010-69）

劉亦恒。E-mail:arosezxr@163.com