張 惠，陽國平

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013)

人體內(nèi)復(fù)方甘草酸苷膠囊藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究

張 惠，陽國平

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013)

目的研究復(fù)方甘草酸苷膠囊在健康男性體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性。方法用自身前后對(duì)照方法，24例健康男性受試者按隨機(jī)號(hào)分為受試組和參比組，交替服用75 mg復(fù)方甘草酸苷膠囊和復(fù)方甘草酸苷片兩種制劑，72 h內(nèi)間斷采血；采用液-質(zhì)聯(lián)用法測定甘草酸苷代謝物甘草次酸的血藥濃度,計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),判定兩制劑是否人體生物等效。結(jié)果復(fù)方甘草酸苷膠囊和片劑在人體內(nèi)藥時(shí)曲線符合二室模型，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC0～t分別為(4 284±1 149)ng·h/ml和(4 513±1 639)ng·h/ml，AUC0～∞分別為(4 369±1 179)ng·h/ml和(4 691±1 839)ng·h/ml，Cmax分別為(290.0±69.6)ng/ml和(293.4±80.9)ng/ml，Tmax分別為(12.08±1.38)h和(11.92±2.32)h；兩種制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax，AUC0～t經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析及雙單側(cè)t檢驗(yàn)，并計(jì)算90%置信區(qū)間，表明兩種制劑人體生物等效，受試制劑復(fù)方甘草酸苷膠囊的人體相對(duì)生物利用度為(112.7±51.6)%。結(jié)論兩制劑具有生物等效。

甘草酸苷；生物等效性；液-質(zhì)聯(lián)用

復(fù)方甘草酸苷膠囊和復(fù)方甘草酸苷片都為甘草酸苷、甘氨酸、蛋氨酸各25 mg組成的復(fù)方制劑，其中甘草酸苷具有抗炎、保護(hù)肝功能等藥理作用。臨床上主要用于慢性肝病和肝功能異常及濕疹等疾病的治療[1-2]。同時(shí)甘氨酸和蛋氨酸具有解毒和抗變態(tài)反應(yīng)作用。主要發(fā)揮藥理作用的是甘草酸苷或其胺鹽在體內(nèi)的代謝物甘草次酸，所以根據(jù)人體血液中甘草酸苷的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律可以評(píng)價(jià)其制劑的生物利用度。由于人血漿中的甘草酸苷代謝物濃度較低，且體內(nèi)代謝物復(fù)雜，一般分析方法如HPLC-UV[3-4]，很難滿足檢測要求。本研究建立了液-質(zhì)聯(lián)用法測定人血漿中甘草次酸的方法，該方法不僅靈敏度和精密度好，而且方便快捷。能有效地考察復(fù)方甘草酸苷膠囊的藥代動(dòng)力學(xué)，作出人體生物等效性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 受試者入選標(biāo)準(zhǔn) 生物等效性試驗(yàn)一般需要做18～24例，我們選擇做24例試驗(yàn)。24名男性健康受試者，體重指數(shù)19.2～24.0 kg/m2，包括邊界值，年齡19～26歲。所有受試者均通過健康體格檢查,實(shí)驗(yàn)室檢查(心電圖、肝腎功能、血常規(guī)等)均屬正常，精神狀態(tài)良好。在試驗(yàn)期1個(gè)月內(nèi)不得抽煙喝酒，且在試驗(yàn)期1個(gè)月內(nèi)不得服用任何其他藥物。所有受試者認(rèn)真閱讀知情同意書，無異議后自愿簽署，并經(jīng)本藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 藥品及試劑 受試制劑(T)：復(fù)方甘草酸苷膠囊(批號(hào)：071101；海南綠島制藥有限公司)；參比制劑(R)：復(fù)方甘草酸苷片(批號(hào)：09047；日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社)；甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品從中國食品藥品檢定研究院購買，含量為99.8%，批號(hào)：110723-200612；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品從中國食品藥品檢定研究院購買，含量為100%，批號(hào)：110742-200517；乙腈(色譜純，美國Fisher公司生產(chǎn))；甲醇(色譜純，美國Fisher公司生產(chǎn))；乙酸乙酯(分析純，西隴化工股份有限公司生產(chǎn))等。

1.3 給藥方案 24例受試者隨機(jī)分成參比組和受試組倆組，每組12例，按2×2交叉方案設(shè)計(jì)，兩期研究間的清洗期為14 d。參比組先服用復(fù)方甘草酸苷片，受試組服用復(fù)方甘草酸苷膠囊，藥物清除期前后服用不同的制劑。在服藥前禁食12 h，第二天早晨空腹口服3粒參比制劑(R)或受試制劑(T)，統(tǒng)一飲水250 ml，服藥后2 h內(nèi)禁水、禁食，至給藥后4 h給予統(tǒng)一低脂標(biāo)準(zhǔn)餐。

1.4 血漿樣品采集 分別于給藥前(0 h)及給藥后2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、10.0 h、12.0 h、14.0 h、18.0 h、24.0 h、36.0 h、48.0 h、60.0 h、72.0 h各取靜脈血4 ml，3 000 r/min離心10 min，分離出血漿約2.5 ml，立即分裝置EP管中于-20℃低溫保存待測。

1.5 血漿樣品測定

1.5.1 色譜條件 Agilent 1200型系列高效液相色譜儀，Agilent 6110質(zhì)譜儀；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6×150 mm；流動(dòng)相采用梯度洗脫；柱溫、流速及流動(dòng)相梯度變化值見表1。在此色譜條件下，甘草次酸的出峰時(shí)間約為4.8 min，內(nèi)標(biāo)物熊果酸的出峰時(shí)間約為8.8 min，兩個(gè)峰之間分離良好，血漿中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾分離，見圖1。

表1 柱溫、流速及流動(dòng)相梯度變化值

圖1 總離子流圖

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，碰撞誘導(dǎo)解離150，干燥氣體流速10 L/min，干燥氣為氮?dú)?，溫?00℃，壓力為40 psig，毛細(xì)管電壓3 000 V，選擇性負(fù)離子監(jiān)測(SIM)，質(zhì)荷比(m/z)為469.4(甘草次酸)，455.4(熊果酸)帶負(fù)電荷的分子離子峰，見圖2。

1.5.3 血漿樣品預(yù)處理 提前將氮吹儀的水浴溫度設(shè)置為45℃，并從超低溫冰箱取出甘草酸苷冰凍血漿樣品，置于室溫下融化，離心約30 s。取10 ml離心管，加入0.5 ml血漿并加入內(nèi)標(biāo)液(6.39 μg/ml) 30 μl，漩渦混勻，加乙酸乙酯5 ml渦旋混合2 min， 3 500 r/min離心10 min。定量吸取乙酸乙酯層4 ml置離心管中，放入45℃水浴鍋中，氮?dú)饬鞔蹈桑〕鲭x心管放涼后，加入100μl甲醇溶解，精密吸取上清液5μl進(jìn)行液-質(zhì)分析，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積定量。

圖2 質(zhì)譜圖

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取甘草次酸對(duì)照品9.9 mg置于100 ml容量瓶中，加適量甲醇振搖溶解，再加入甲醇定容，制得99μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取內(nèi)標(biāo)物熊果酸9.4 mg置于100 ml容量瓶中，加適量甲醇振搖溶解，再加入甲醇定容，制得94 g/ml儲(chǔ)備液，逐步用甲醇稀釋得6.39 g/ml的內(nèi)標(biāo)液。取健康人空白血漿10 ml若干份，分別加入甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制濃度分別為1.96 ng/ml、4.9 ng/ml、19.8 ng/ml、79.2 ng/ml、158.4 ng/ml、316.8 ng/ml和633.6 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。按“1.5.3”項(xiàng)下操作，同時(shí)制備空白樣品，進(jìn)行液-質(zhì)分析，計(jì)算甘草次酸峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值F。以比值F(F=As/Ai)對(duì)血藥濃度C作回歸計(jì)算，得回歸方程F=0.001 8C+0.002 4，權(quán)重系數(shù)w=1/C2，r= 0.999 5，甘草次酸濃度在1.96～633.6 ng/ml與峰面積比線性良好，最小可定量濃度為1.96 ng/ml。

1.5.5 檢測方法驗(yàn)證 取甘草次酸儲(chǔ)備液，用甲醇逐步稀釋配制得4.9 ng/ml、79.2 ng/ml、316.8 ng/ml的3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“1.5.3”項(xiàng)處理后進(jìn)行液-質(zhì)分析，同時(shí)配制相應(yīng)濃度對(duì)照品甲醇溶液，進(jìn)行液-質(zhì)分析，分別記錄兩種樣品的色譜峰面積，將兩者進(jìn)行比較計(jì)算萃取回收率。另取甘草次酸儲(chǔ)備液，用甲醇逐步稀釋配制得4.9 ng/ml、79.2 ng/ml、316.8 ng/ml三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按以上樣品處理方法進(jìn)行處理后，取樣進(jìn)行檢測分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，將所得的濃度與已知加入濃度相比，計(jì)算相對(duì)回收率，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，見表2。

表2 甘草次酸回收率及精密度測定結(jié)果(n=5，±s)

表2 甘草次酸回收率及精密度測定結(jié)果(n=5，±s)

4.9 79.2 316.8 85.6±3.2 88.1±1.8 89.5±0.5 96.4±1.6 97.8±2.0 97.5±1.4 4.0 3.9 1.0 6.5 3.6 1.3

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用DAS2.1版軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，參數(shù)用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以末端相血藥濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)時(shí)間進(jìn)行回歸，求得斜率Ke及T1/2，運(yùn)用梯形法計(jì)算曲線下面積AUC0～t，AUC0～∞=AUC0～t+ct/Ke；以實(shí)測值計(jì)算Cmax和Tmax。AUC0～t和Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，在a=0.05水平進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)，按受試制劑Cmax在參比制劑75%～133%，AUC0～t在80%～125%內(nèi)判定標(biāo)準(zhǔn)，考察兩制劑是否具有人體生物等效性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 24例志愿者交替口服復(fù)方甘草酸苷膠囊與片劑75 mg平均藥時(shí)曲線見圖3，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

圖3 24例志愿者口服兩種復(fù)方甘草酸苷制劑后的甘草次酸平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表3 24例志愿者口服兩種復(fù)方甘草酸苷制劑后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=5，±s)

表3 24例志愿者口服兩種復(fù)方甘草酸苷制劑后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=5，±s)

參數(shù)AUC0～t(ng·h/ml) AUC0～∞(ng·h/ml) T1/2(vh) Tmax(h) Cmax(ng/ml)參比制劑4284±1149 4369±1179 8.242±3.402 12.08±1.38 290.0±69.6受試制劑4513±1639 4691±1839 7.840±4.137 11.92±2.32 293.4±80.9

2.2 人體生物等效性 兩種制劑間和給藥次序間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Cmax在不同給藥周期間無顯著差異，雙單側(cè)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)th和tl兩藥均大于單側(cè)t(0.05，18)(1.75)，AUC0T、AUC0～∞在不同給藥周期間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方差分析表明：兩種制劑的AUC0T、AUC0～∞、Cmax在劑型間、個(gè)體間和周期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)方甘草酸苷片和復(fù)方甘草酸苷膠囊中甘草次酸的Tmax值經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，不同制劑間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.587，P=0.557)。按照生物等效性的標(biāo)準(zhǔn)判定兩種不同制劑生物等效，分析結(jié)果見表4。

表4 人體生物等效性分析結(jié)果

2.3 受試者臨床觀察結(jié)果 受試者空腹口服75 mg甘草酸苷后，所有受試者身體無明顯不良反應(yīng)發(fā)生。

3 討論

該研究采用液-質(zhì)聯(lián)用法測定人血漿樣品中甘草酸苷的代謝物甘草次酸的濃度，文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相組分為甲醇、冰醋酸水溶液[5-7]，由于我們選擇負(fù)離子為檢測離子，所以流動(dòng)相組分選擇為乙腈和醋酸銨溶液，醋酸銨有效地提高了甘草次酸的離子化，使其質(zhì)譜響應(yīng)值顯著增大；同時(shí)我們以單一溶劑乙酸乙酯萃取血漿樣品，操作簡單快捷，較文獻(xiàn)報(bào)道的使用混合溶劑乙醚-二氯甲烷或乙醚-乙酸乙酯萃取回收率高；并較固相萃取法[8]操作簡單，且很大地節(jié)約了試驗(yàn)成本。本法不僅樣品預(yù)處理操作簡便，而且靈敏度和精密度好，適于甘草酸苷藥代動(dòng)力學(xué)及人體生物等效性研究。

24名受試者口服復(fù)方甘草酸苷膠囊與復(fù)方甘草酸苷片后，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明兩種制劑在人體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程基本相似。經(jīng)計(jì)算受試制劑的平均相對(duì)生物利用度為(112.7±51.6)%；經(jīng)人體生物等效性統(tǒng)計(jì)分析，均表明兩種不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方甘草酸苷制劑具有人體生物等效性。

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Study on bioequivalence and pharmacokinetics of compound glycyrrhizin capsules in healthy volunteers.

ZHANG Hui,YANG Guo-ping.The Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410013,Hunan, CHINA

Objective To study the bioequivalence and pharmacokinetics of compound glycyrrhizin capsules in human plasma.Methods75 mg compound glycyrrhizin preparations were given to 24 healthy male volunteers in randomized two-way crossover design for the pharmacokinetic and relative bioavailability study.The volunteers were equally and randomly divided into test preparation group and reference preparation group,which were given compound glycyrrhizin capsules followed by compound glycyrrhizin tablets,compound glycyrrhizin tablets followed by compound glycyrrhizin capsules,respectively,with an interval of 14 d.The blood samples were collected within 72 h after taking medicine.Plasma concentration of glycyrrhetic acid were determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS).ResultsThe concentration-time curves of compound glycyrrhizin capsules and compound glycyrrhizin tabletsin vivowere in accordance with two compartment model.The main pharmacokinetic parameters of the two preparations were:AUC0～t(4 284±1 149)ng·h/ml and(4 513±1 639)ng·h/ml,AUC0～∞(4 369±1 179)ng·h/ml and(4 691±1 839)ng·h/ml,respectively,Cmax(290.0±69.6)ng/ml and(293.4±80.9)ng/ml,Tmax(12.08±1.38)h and(11.92±2.32)h.The mean relative bioavailability of test preparation to reference preparation were (112.7±51.6)%.ConclusionThe reference preparation and the test preparation are bioequivalent.

Glycyrrhetic acid;Bioequivalence;High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)

R969.1

A

1003—6350（2015）19—2931—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1067

2015-01-05)

陽國平。E-mail：ygp9880@163.com