劉艷紅

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中單核/巨噬細(xì)胞IL-1、IL-6的表達(dá)

劉艷紅

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

目的 探索脂多糖的作用下單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子與急性冠脈綜合征病程的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。方法體外培養(yǎng)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)，實(shí)驗(yàn)組加脂多糖，對(duì)照組空白，按一定的時(shí)間間隔取一定體積培養(yǎng)液，用ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-1α濃度，觀測(cè)其變化情況及何時(shí)達(dá)到峰值。并對(duì)出現(xiàn)峰值最早的IL-1β進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。結(jié)果ELISA顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度也發(fā)生相應(yīng)的改變，IL-1β在3時(shí)達(dá)到峰值，IL-6在16時(shí)達(dá)到峰值，IL-1α在18時(shí)達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論脂多糖影響巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-1α的表達(dá)；達(dá)到峰值的時(shí)間不同，說(shuō)明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的時(shí)間起主導(dǎo)作用。

白介素-1β；白介素-6；白介素-1α；脂多糖；動(dòng)脈粥樣硬化

急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)主要是由于動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心血管疾病，近年來(lái)已發(fā)展成為危及人類健康的主要疾病之一[1]。近10多年的研究成果已經(jīng)證實(shí)AS是血管壁的慢性炎癥過(guò)程，炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。大量的單核/巨噬細(xì)胞經(jīng)趨化因子誘導(dǎo)出現(xiàn)在不穩(wěn)定的粥樣斑塊內(nèi)，激活后可產(chǎn)生多種蛋白酶，降解破壞細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時(shí)可分泌多種炎性因子，如IL-1α、IL-1β、IL-6等[2]，它們通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞自身在AS和ACS發(fā)病中起一定作用，我們探討炎癥性細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人單核/巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的變化，從而揭示其在AS病程中可能的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 THP-1細(xì)胞系(本實(shí)驗(yàn)室保存)；LPS試劑購(gòu)自Sigma公司；1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；IL-1α的ELISA試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)EK0410)，IL-1β的ELISA試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)EK0389)，IL-6的ELISA試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)EK 0392)均由武漢博士德生物工程有限公司提供。凝膠成像掃描系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；UV-265紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；PCR儀(PTC-225，MJ research公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含抗生素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清。飽和濕度及5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2 LPS處理THP-1細(xì)胞 待細(xì)胞培養(yǎng)密度到85%以上，等體積無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化細(xì)胞2 h，用1%血清的低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基2 ml重懸細(xì)胞，并加入LPS(終濃度為10 ng/ml)，置培養(yǎng)箱孵育，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h收集培養(yǎng)基，放入對(duì)應(yīng)EP管，4℃凍存待測(cè)IL-1β；分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h收集培養(yǎng)基，放入對(duì)應(yīng)EP管，4℃凍存待測(cè)IL-1α和IL-6。分別于0 h、1 h、2 h、4 h收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)IL-1β的表達(dá)。

1.2.3 ELISA法測(cè)IL-1、IL-6濃度 按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)樣本IL-1、IL-6濃度。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-1β的表達(dá) 提取總RNA，內(nèi)參18SrRNA上游引物為5'-CGGCTACCA CATCCAAGGAA-3'，下游引物為5'-GCTGGAATTA CCGCGGCT-3'；目的基因 IL-1β上游引物為5'-AATGATGGCTTATTACAGTGGCA-3'，下游引物5'-GCTGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3'。配制實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)液：SYBR Premix ExTaq(2×) 12.5 μl，上游引物(20 μmol/L)1 μl，下游引物(20 μmol/L) 1 μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，加滅菌蒸餾水至總體積至25 μl。PCR擴(kuò)增條件為：IL-1β95℃預(yù)變性3 min，然后95℃30 s、63℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；內(nèi)參18 s rRNA 95℃預(yù)變性3 min，然后95℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果處理：相對(duì)定量2-ΔΔCt法，ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目的基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)，ΔCt (對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)，表達(dá)倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Graph-PadPrism5版對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)值。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)IL-1β濃度的時(shí)間曲線 LPS作用THP-1細(xì)胞后，按照一定的時(shí)間收集培養(yǎng)基，使用ELISA方法檢測(cè)IL-1β的濃度。第3小時(shí)IL-1β的積累濃度達(dá)到峰值，此時(shí)IL-1β的濃度為33.484 4 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖1。

2.2 ELISA檢測(cè)IL-6濃度的時(shí)間曲線 LPS作用THP-1細(xì)胞后，按照一定的時(shí)間收集培養(yǎng)基，使用ELISA方法檢測(cè)IL-6的濃度。第16小時(shí)IL-6的積累濃度達(dá)到峰值，此時(shí)IL-6的濃度為33.487 5 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖2。

圖1 IL-1β濃度的時(shí)間曲線

圖2 IL-6濃度的時(shí)間曲線

2.3 ELISA檢測(cè)IL-1α濃度的時(shí)間曲線 LPS作用THP-1細(xì)胞后，按照一定的時(shí)間收集培養(yǎng)基，使用ELISA方法檢測(cè)IL-1α的濃度。第18小時(shí)IL-1α的積累濃度達(dá)到峰值，此時(shí)IL-1α的濃度為75.780 4 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖3。

圖3 IL-1α濃度的時(shí)間曲線

2.4 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)IL-1β的表達(dá) 對(duì)最早達(dá)到峰值的IL-1β，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其在LPS作用下的表達(dá)情況。對(duì)照組的mRNA水平為(1.211±0.2120)，LPS作用THP-1細(xì)胞1 h后表達(dá)量達(dá)到(3.294±0.7220)，是對(duì)照組的2.72倍；2 h后達(dá)到(5.631±1.0570)，是對(duì)照組的4.65倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。這與ELISA檢測(cè)的結(jié)果相吻合。

圖4 LPS對(duì)THP-1細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響

3 討論

AS是導(dǎo)致眾多心腦血管疾病的主要原因之一，嚴(yán)重危害人類健康，深入研究AS發(fā)病的機(jī)制意義重大。1999年Ross明確提出“AS是一種炎癥性疾病”，因此感染因素在AS的發(fā)生與發(fā)展中所扮演的角色得到大量研究者的重視。LPS是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，其作用于參與心血管事件的各類型細(xì)胞，比如：內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等就成為觀察AS在模擬炎癥狀態(tài)的有效的細(xì)胞模型。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了大量參與AS的炎性因子，并且它們?cè)贏S的不同發(fā)展階段得到表達(dá)。這些炎癥因子作為一種介質(zhì)，作用于參與AS形成的內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板等，并通過(guò)自分泌以及旁分泌的形式使它們相互聯(lián)系，相互影響[3]。因此，探討AS炎癥過(guò)程的相關(guān)因子，研究這些炎癥因子在整個(gè)AS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的濃度變化，對(duì)了解動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程有一定的意義。本文選擇了IL-1α、IL-1β、IL-6三種白介素作為檢測(cè)AS炎癥進(jìn)程的指標(biāo)。

IL-6由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞的增殖、分化以及機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，是機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)[4]。AS斑塊中發(fā)現(xiàn)有IL-6的表達(dá)，可能通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和TNF-α的表達(dá)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。研究顯示ACS患者循環(huán)血液中的IL-6含量高于穩(wěn)定性心絞痛患者以及健康對(duì)照，不穩(wěn)定型心絞痛患者如果入院后48 h IL-6水平較入院時(shí)升高，則易發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件，包括死亡、心肌梗死或頑固性心絞痛[5]。

IL-1β是一種炎性細(xì)胞因子，具有多種致AS發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)[6]。它主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-1。研究表明IL-1β通過(guò)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生、促進(jìn)白細(xì)胞粘附于內(nèi)皮、調(diào)節(jié)低密度脂蛋白(LDL)代謝、誘導(dǎo)MMPs合成、增加血管通透性、抑制血管收縮以及增加促凝活性參與血管功能的調(diào)節(jié)[7]。因此IL-1可能參與了AS的發(fā)病以及球囊擴(kuò)張術(shù)后血管內(nèi)皮的損傷愈合過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：LPS刺激THP-1細(xì)胞，三種白介素累積量達(dá)到高峰值時(shí)間和濃度各不相同，IL-1β在LPS刺激3 h即達(dá)到高峰，說(shuō)明IL-1β產(chǎn)生時(shí)間最早，產(chǎn)生速率快，可能在炎癥反應(yīng)的早期起作用。IL-1α和IL-6分別于18 h和16 h達(dá)到高峰，產(chǎn)生速率較慢，可能在炎癥后期起作用。有資料顯示動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中IL-1β的產(chǎn)生對(duì)IL-6的產(chǎn)生有促進(jìn)作用：在IL-1β存在的情況下，IL-6各階段累積量多，而在缺乏IL-1β的情況下，IL-6累積量顯著減少。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示IL-1β開始產(chǎn)生與達(dá)到峰值都先于IL-6，一定程度上可驗(yàn)證這一說(shuō)法。同時(shí)有研究表明IL-1β可誘導(dǎo)IL-6合成。

巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，形成泡沫細(xì)胞是AS的標(biāo)志[8]，其產(chǎn)生炎癥因子隨時(shí)間的變化在一定程度上反映了動(dòng)脈粥樣硬化的程度，LPS誘發(fā)THP-1細(xì)胞的反應(yīng)表明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的時(shí)間起主導(dǎo)作用，同時(shí)相互之間有一定促進(jìn)依存關(guān)系。借此對(duì)疾病的診斷有一定的幫助。

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Expression of IL-1 and IL-6 of macrophages in the process of atherosclerosis.

LIU Yan-hong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the relationships between acute coronary syndrome and inflammatory factors which were produced by macrophages with lipopolysaccharide(LPS).MethodsThe THP-1 cells were culturedin vitroand divided into research group and control group at random.LPS was used in the research group,but not in the control group.The concentration of interleukin-1β(IL-1β),interleukin-1α(IL-1α),interleukin-6(IL-6)were determined by ELISA.The expression of IL-1βwas determined by real time PCR.ResultsThe results of ELISA showed that the concentrations of IL-1β,IL-1α,IL-6 were changing with time courses.The peak value of IL-1βwas observed at 3 h,with that IL-6 observed at 16 h and that of IL-1αobserved at 18 h.The differences between the research group and the control group were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe LPS affects the expression of IL-1β,IL-6,IL-1αof macrophages,with the peak values observed at different time points,which indicates that IL-1β,IL-6 and IL-1αplay the leading role at different times in the process of acute coronary syndrome.

Interleukin-1β(IL-1β);Interleukin-6(IL-6);Interleukin-1α(IL-1α);Lipopolysaccharide (LPS);Atherosclerosis(AS)

R541.4

A

1003—6350（2015）19—2818—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1028

2015-03-25)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81170273)

劉艷紅。E-mail：1376090683@qq.com