周靜，陳建安，丁茜，何永明，吳東升，陳麗莉

(中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院檢驗(yàn)科1、血液內(nèi)科2，廣東東莞523110)

CD8+CD28+Tc細(xì)胞在急性白血病患者化療前后外周血中的表達(dá)及臨床意義

周靜1，陳建安1，丁茜1，何永明1，吳東升2，陳麗莉1

(中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院檢驗(yàn)科1、血液內(nèi)科2，廣東東莞523110)

目的探討CD8+CD28+Tc細(xì)胞在急性白血病患者化療前后外周血中的表達(dá)及其臨床意義。方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測急性白血病初診患者40例，化療后完全緩解患者30例和健康體檢者30例的外周血CD8+CD28+Ts細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果急性白血病初診患者外周血中CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率為(7.83±4.83)%，較健康對照組表達(dá)率[(14.92±4.13)%]明顯偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；化療后完全緩解患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率為(8.21±5.68)%，較健康對照組明顯偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；完全緩解組外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率與初診患者組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；緩解組CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率為(43.87±16.47)%，均比初診患者組[(31.53±7.25)%]和健康對照組[(33.65±7.08)%]的表達(dá)率明顯偏高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；急性髓細(xì)胞白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率分別為(7.90±4.63)%和(6.47±2.86)%，均明顯低于健康對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的直線回歸相關(guān)系數(shù)r=0.098，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其無正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論CD8+CD28+Tc細(xì)胞在急性白血病初診患者和化療后完全緩解患者的外周血中表達(dá)明顯偏低，提示其抗腫瘤能力下降，需要通過有效干預(yù)患者的免疫功能，提高機(jī)體的抗腫瘤能力，對提高急性白血病的療效有重要意義。

急性白血?。荒[瘤；外周血；CD8+CD28+Tc

目前認(rèn)為免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視是抗腫瘤作用的第一道防線，有研究[1]結(jié)果表明，腫瘤組織內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞數(shù)量越多，其抗腫瘤作用越明顯，預(yù)后更好。CD8+CD28+Tc細(xì)胞是一種殺傷性免疫細(xì)胞，對腫瘤的免疫監(jiān)視及殺傷中起重要作用，急性白血病作為惡性非實(shí)體性腫瘤，其外周血的分布情況及其免疫抑制中的作用目前尚不清楚。本研究通過對急性白血病患者治療前和化療后CD8+CD28+Tc細(xì)胞在外周血表達(dá)水平的變化規(guī)律，探討CD8+CD28+Tc細(xì)胞的抗腫瘤作用，為有效干預(yù)患者的免疫功能提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2013年5月至2014年5月前來我院就診的初診急性白血病患者40例，抽取外周乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 ml，同時(shí)抽取骨髓液涂片送檢做骨髓形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)分析，并抽取肝素抗凝骨髓液送檢用流式細(xì)胞儀做白血病免疫分型，從而確診急性白血病和分型，其中男性23例，女性17例，年齡16～65歲。選取部分在我院化療后完全緩解者30例，同時(shí)選擇健康體檢人群30例，抽取外周EDTA抗凝全血。

1.2 試劑與儀器儀器為美國貝克曼-庫爾特公司的FC500 MCL流式細(xì)胞儀，日本奧林巴斯BX-51型顯微鏡；試劑為廣州康潤試劑公司提供的貝克曼-庫爾特公司生產(chǎn)的CD45-藻紅蛋白-花青苷7 (Phycoerythrin cyanin 7，PC7)/CD28-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/CD8-藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)等熒光抗體試劑，磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution，PBS)，紅細(xì)胞裂解液。

1.3 檢測方法分別加入CD45-pc7、CD8-PE、CD28-FITC熒光抗體試劑各5μl至同一流式專用管內(nèi)底端，同時(shí)加入50μl抗凝全血避光反應(yīng)20 min，加入RBC裂解液500μl，避光20 min后加入PBS上機(jī)檢測，用CD45/SS設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞群，在十字門圖中分析CD8+而CD28-性區(qū)域細(xì)胞的百分比，即為CD8+CD28-Ts細(xì)胞表達(dá)率；在CD8+而CD28+性區(qū)域的百分比，即為CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率；在CD8+性區(qū)域的百分比，即為CD8+T細(xì)胞表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，線性回歸方法分析CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組受試者間的CD8+CD28-Ts細(xì)胞表達(dá)率比較初診患者組和化療后完全緩解組的外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率均明顯低于健康對照組(t= 5.68、4.35，P＜0.01)；完全緩解組外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率與初診患者組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.286，P＞0.05)，且CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率均明顯高于健康對照組和初診患者組(t=2.985、4.556，P＜0.01)，見表1。

表1 各組受試者間的CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率比較(±s，%)

表1 各組受試者間的CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率比較(±s，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.01；完全緩解組與初診患者組比較，bP＜0.01。

組別例數(shù)C D8+C D28+T c細(xì)胞C D8+T細(xì)胞初診患者組完全緩解組健康對照組4 0 3 0 3 0 7 . 8 3 ± 4 . 8 3a8 . 2 1 ± 5 . 6 8a1 4 . 9 2 ± 4 . 1 3 3 1 . 5 3 ± 7 . 2 5 4 3 . 8 7 ± 1 6 . 4 7ab3 3 . 6 5 ± 7 . 0 8

2.2 初診患者急性髓細(xì)胞白血病[AML，不包括急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)]、APL和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)與健康對照組間CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率比較AML和ALL外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率均明顯低于健康對照組(t=5.138、4.667，P＜0.01)；APL組的CD8+T細(xì)胞表達(dá)率明顯低于健康對照組(t=2.852，P＜0.01)；AML和ALL組的CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率均明顯高于APL組(t=2.112、2.080，P＜0.05)，見表2。

表2 AML(不包括APL)、APL和ALL與健康對照組間CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率比較(±s，%)

表2 AML(不包括APL)、APL和ALL與健康對照組間CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率比較(±s，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.01；與APL比較，bP＜0.05。

組別例數(shù)C D8+C D28+T c細(xì)胞C D8+T細(xì)胞A M L (不包括A P L ) A L L A P L健康對照組2 8 6 6 3 0 7 . 9 0 ± 4 . 6 3a6 . 4 7 ± 2 . 8 6a1 0 . 5 8 ± 6 . 2 3 1 4 . 9 2 ± 4 . 1 3 3 2 . 7 2 ± 6 . 9 3b3 0 . 8 7 ± 4 . 4 5b2 6 . 6 2 ± 1 0 . 1 5a3 3 . 6 5 ± 7 . 0 8

2.3 急性白血病患者CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的直線回歸相關(guān)系數(shù)r=0.098，相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其無正相關(guān)關(guān)系，見圖1。

圖1 CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的直線回歸關(guān)系圖

3 討論

CD28分子為細(xì)胞共刺激分子，表達(dá)于95%的CD4+和50%～95%的CD8+T細(xì)胞上，能與抗原提呈細(xì)胞上的B7分子結(jié)合所介導(dǎo)的共刺激信號協(xié)助激活T細(xì)胞的增殖和包括IL-2在內(nèi)的多種淋巴因子的分泌，并能阻止細(xì)胞無反應(yīng)性的誘導(dǎo)。CD8+T細(xì)胞根據(jù)CD28的表達(dá)與否分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+CD28+)和抑制性T細(xì)胞(CD8+CD28+)。CD8+CD28+T細(xì)胞主要為激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，與腫瘤直接接觸，通過排粒作用釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，溶解靶細(xì)胞；同時(shí)還可能釋放一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[2]。在機(jī)體內(nèi)，CTL的活化需要雙信號刺激，首先腫瘤細(xì)胞通過表面的MHCI-腫瘤抗原肽復(fù)合物與TCR-CD3結(jié)合形成活化的第一信號；同時(shí)腫瘤表面上的協(xié)同刺激分子，如B7、細(xì)胞間粘附分子1、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子-3(LFA-3)等，與CTL上相應(yīng)的分子受體CD28、LFA-1及LFA-2等結(jié)合形成活化的第二信號。CD8+CD28+Tc細(xì)胞減少及CD8+CD28-Ts細(xì)胞增加是T淋巴細(xì)胞功能下降的標(biāo)志[3-4]。CD8+CD28+Tc細(xì)胞數(shù)量顯著減少，導(dǎo)致機(jī)體缺乏有效的“第二信使”來活化CD8+T細(xì)胞，從而使機(jī)體免疫功能下降[5-6]。

有文獻(xiàn)[7-10]報(bào)道CD8+CD28+Tc細(xì)胞在多種腫瘤患者的外周血表達(dá)比例降低，劉曉光等[7]報(bào)道了51例結(jié)腸癌患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞較健康對照組有明顯降低，分別為(8.60±3.95)%和(13.37±2.78)% (P＜0.01)。宋丁等[8]報(bào)道了38例原發(fā)性肝癌患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞較健康對照組有明顯降低(P＜0.01)，分別為(9.42±2.90)%和(12.68±3.67)%。吉順榮等[9]報(bào)道了52例B細(xì)胞胰腺癌患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞較正常對照組有明顯降低(P＜0.01)，分別為(9.88±4.32)%和(14.12±4.95)%。杜曉輝等[10]報(bào)道了胃癌患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞較健康對照組有明顯降低。本研究中急性白血病初診患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)率為(7.83±4.83)%，較健康對照的組(14.92±4.13)%有明顯減低(P＜0.01)，與上述腫瘤患者的報(bào)道相符。提示除了CD8+CD28+Tc細(xì)胞在急性白血病患者抗腫瘤效應(yīng)作用減少，化療后完全緩解患者的CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)率較初診患者無明顯變化，可能化療對機(jī)體的免疫功能有一定的損傷作用，從而使患者的抗腫瘤作用無明顯增加，因此需要通過免疫調(diào)節(jié)治療的手段干預(yù)患者的CD8+CD28+Tc細(xì)胞表達(dá)，使其表達(dá)上調(diào)，從而提高患者的抗腫瘤作用，可能對殺死殘留白血病細(xì)胞和減少復(fù)發(fā)率有一定的作用。

在急性白血病的各分型之間，發(fā)現(xiàn)AML、ALL和APL患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)均低于對照組，存在明顯差異，而AML、ALL與APL患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞的表達(dá)無明顯差別，因標(biāo)本的數(shù)量較少，其關(guān)系有待進(jìn)一步研究。健康個(gè)體CD8+CD28+Tc細(xì)胞CD8+CD28-Ts細(xì)胞的表達(dá)率對外周血CD8+T細(xì)胞的升高具有相同的功能，然而在一些感染、慢性疾病和腫瘤疾病中并非如此，有的是CD8+CD28+Tc細(xì)胞升高而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞升高，有的是CD8+CD28-Ts細(xì)胞升高而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞升高[11]，因此不同的疾病它們之間的關(guān)系可能有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)急性白血病患者外周血CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+細(xì)胞無正相關(guān)，因此外周血CD8+T細(xì)胞的升高不是由CD8+CD28+Tc細(xì)胞的升高而導(dǎo)致，本研究中CD8+CD28+Tc細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的直線回歸相關(guān)系數(shù)r=0.098，相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CD8+CD28+Tc細(xì)胞在急性白血病初診患者和化療后完全緩解患者的外周血中表達(dá)明顯偏低，抗腫瘤作用減弱，因此需要通過有效的干預(yù)患者的免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤作用的能力，對提高急性白血病的療效有重要意義。

[1]Melief CJ,Toes RE,Medema JP,et al.Strategies for immunotherapy of cancer[J].Adv Imumunol,2000,75∶235-282.

[2]鄒春英,呂培中,宋峰,等.老年肺癌患者血清T淋巴細(xì)胞CD8+CD28+的檢測及臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(18)∶1389-1391.

[3]Alves NL,Arosa FA,Vanlier RA.IL-21 sustains CD28express on IL-15 activated human na?ve CD8+T cells[J].J Immunol,2005,175 (2)∶755-762.

[4]Godlove J,Chiu WK,Weng NP.Gene expression and generation of CD28-CD8T cells mediated by interleukin 15[J].Exp Gerontol, 2007,42(5)∶412-415.

[5]Martinez-Escribano JA,Hernandez-Caselies T,Campillo JA,et al. Changes in the number of CD80+,CD66+,and CD28+peripheral blood lymphocytes have progonoatic value in melanoma patients[J]. Hurn Immunol,2003,64(8)∶796-801.

[6]Tsukishiro T,Donnenberg AD,Whiteside TL.Rapid turnover of the CD8+CD28-T cell subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2003, 52(10)∶599-607.

[7]劉曉光,金秀國,劉波,等.結(jié)腸癌患者外周血淋巴細(xì)胞CD8和CD28的表達(dá)[J].腫瘤學(xué)雜志,2007,13(1)∶68-69.

[8]宋丁,王燕云.CD8+CD28-T細(xì)胞在原發(fā)性肝癌患者外周血的表達(dá)及意義[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009,13(4)∶493-494.

[9]吉順榮,姚宛彤,張波,等.胰腺癌患者外周血CD8+CD28+和CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞亞群的分析[J].上海醫(yī)學(xué),2012,35(4)∶316-319.

[10]杜曉輝,林利利,寧寧,等.胃癌患者血清調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的檢測及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013,30 (12)∶2704-2706.

[11]裘宇容,楊春莉,陳煉波,等.原發(fā)性肝癌患者CD8+CD28-和CD8+CD28+T細(xì)胞亞群的分析[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(1)∶72-73．

Expression of CD8+CD28+Tc cell in the peripheral blood of patients with acute leukemia before and after chemotherapy and its clinical significance.

ZHOU Jing1,CHEN Jian-an1,DING Qian1,HE Yong-ming2,WU Dong-sheng2,CHEN Li-li1.Department of Clinical Laboratory1,Department of Hematology and Oncology2,Donghua Hospital Affiliated to Zhongshan University,Dongguan 523110,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of CD8+CD28+Tc cell in the peripheral blood of patients with acute leukemia before and after chemotherapy and its clinical significance.MethodsThe expression rates of CD8+CD28+Tc cell in peripherical blood were detected by flow cytometry in 40 newly diagnosed patients with acute leukemia(group A),30 patients with complete remission after chemotherapy(group B),and 30 healthy physical examiners(group C).ResultsThe expression rate of CD8+CD28+Tc cell of group A was(7.83±4.83)%,significantly lower than that of group C[(14.92±4.13)%,t=5.68,P＜0.01].The expression rate of CD8+CD28+Tc cell of group B was (8.21±5.68)%,which was significantly lower than that of group C(P＜0.01)and not significantly different from that of group A(P＞0.05).The expression rate of CD8+T cell in group B was significantly higher than that of group A and group C[(43.87±16.47)%vs(31.53±7.25)%and(33.65±7.08)%,P＜0.01].The expression rate of CD8+CD28+Tc cells of acute myelocytic leukemia(AML)and acute lymphoblastic leukemia(ALL)were(7.90±4.63)%and(6.47±2.86)%, significantly lower than those of group C(P＜0.01).The linear regression correlation coefficient(r)between CD8+CD28+Ts cells and CD8+T cells was 0.098,with no statistically significant difference(P＞0.05)and no positive correlation between them.ConclusionThe expressions of CD8+CD28+Tc cells in peripheral blood in newly diagnosed patients with acute leukemia and those in complete remission after chemotherapy are significantly lowered,indicating its decreased anti-tumor ability.To effectively intervene in immunity function of patients and to improve the anti-tumor ability are of great significant to improve the curative effect of acute leukemia.

Acute leukemia;Tumor;Peripheral blood;CD8+CD28+Tc

R733.71

A

1003—6350（2015）12—1778—03

2014-11-22)

東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號：20131051010238）

周靜。E-mail：50939593@qq.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2015.12.0636