鐘桂芳，樊 攀，毛多斌

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450002;2.江蘇九旭藥業(yè)有限公司，江蘇徐州221200)

蘆薈的主要活性成分是蘆薈大黃素，該成分具有抗腫瘤、抗菌、免疫抑制和瀉下作用，還具有降脂減肥和去屑光澤頭發(fā)等功效［1］。該化合物是制備治療關(guān)節(jié)炎藥物雙醋瑞因的重要原料［2］。蘆薈苷是C-C糖苷鍵，非常穩(wěn)定，是所有糖苷鍵中最難水解的，這一特性制約了蘆薈苷轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素，成為世界性難題。國際上通常采用化學(xué)法來斷裂該鍵，這些方法的缺陷是使用了金屬試劑，或其他有害或有毒物質(zhì)，并且需要復(fù)雜的純化工藝，以去除上述的殘留物［3-6］。

河南省為蘆薈種植大省，但目前蘆薈加工產(chǎn)品依然停留在蘆薈原汁和干粉上，產(chǎn)品的附加值較低。本研究采用生物酶法有效地水解蘆薈苷C-C糖苷鍵，制備蘆薈大黃素，為蘆薈大黃素的大規(guī)模的生物法制備奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

蘆薈苷及蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品，購買自SIGMA公司;蘆薈大黃素樣品1mg實(shí)驗室制備;葡萄糖苷酶，鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物催化與轉(zhuǎn)化實(shí)驗室制備;Waters高效液相色譜系統(tǒng);XTerra MS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);Waters 1525型紫外檢測器;Waters 2487型高壓恒流泵;檢測波長254 nm;流動相:V(甲醇)∶V(0.1%乙酸水溶液)=80∶20;進(jìn)樣量10 μL;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:30 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，加入適量乙酸乙酯，超聲10 min促使溶解，冷卻后，以甲醇定容至50 mL，配制成1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g·L-1的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 重組葡萄糖糖苷酶水解蘆薈苷合成蘆薈大黃素 稱取蘆薈苷5 g，放入500 mL圓底燒瓶內(nèi)，依次加入65 mL醋酸緩沖液(20 mmol·L-1，pH值5.2)，30 mL叔丁醇和5 mL重組葡萄糖苷酶粗酶液，在50℃、150 r·min-1條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)液經(jīng)用HPLC和TLC檢測。蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率計算公式如下:

1.2.3 蘆薈大黃素的分離純化 反應(yīng)液在60℃條件下真空干燥，經(jīng)索氏提取后，5℃放置結(jié)晶，抽濾后，濾餅以10 mL甲苯洗滌2次，該洗滌液60℃真空干燥得蘆薈大黃素粗品。將濃縮的蘆薈大黃素甲苯溶液加入硅膠柱中，乙酸乙酯洗脫。將含有蘆薈大黃素的洗脫液合并后，減壓濃縮得棕黃色的殘渣。用薄層層析和高效液相色譜等檢測蘆薈大黃素純度。

1.2.4 各試驗因素對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響 根據(jù)蘆薈大黃素的合成方法，分別在 1、2、4、6、8、10、12 h時間取樣檢測，考察反應(yīng)時間對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響;調(diào)整加酶量，分別在體積酶活性為40、45、50、55、60 U·mL-1條件下進(jìn)行合成試驗，考察體積酶活性對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響;調(diào)整底物質(zhì)量濃度，分別在蘆薈苷質(zhì)量濃度為50、75、100、125、150 g·L-1時合成試驗，考察蘆薈苷質(zhì)量濃度對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響;考察叔丁醇與水的體積比對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響，分別在叔丁醇和水的體積比為 1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1 條件下進(jìn)行合成試驗;考察反應(yīng)溫度對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響，分別在30、40、50、60、70 ℃等下進(jìn)行合成試驗;考察pH值對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化的影響，分別在pH值為 3.6、4.2、5.2、6.2、7.2、8.0 時進(jìn)行試驗。

1.2.5 響應(yīng)曲面試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken模型，以蘆薈大黃素的質(zhì)量百分濃度為響應(yīng)值，以反應(yīng)時間(X1)、叔丁醇體積分?jǐn)?shù)(X2)、反應(yīng)溫度(X3)作為影響類蘆薈大黃素合成的主要因素，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，水平編碼見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對蘆薈大黃素合成的影響

由圖1可知，反應(yīng)時間對蘆薈大黃素的合成有很大影響。在前4 h內(nèi)，隨著時間的延長，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率呈增加的趨勢，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)84.58%;當(dāng)反應(yīng)時間超過4 h之后，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率基本維持在80%左右。因此，為保證蘆薈大黃素的產(chǎn)量和工作效率，選擇4 h作為最適反應(yīng)時間。

圖1 反應(yīng)時間對蘆薈大黃素合成的影響Fig.1 Effects of reaction time on the synthesize of Aloe-emodin

2.2 酶濃度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率與重組葡萄糖苷酶體積酶活性呈正相關(guān)關(guān)系。隨著體積酶活性的增加，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率不斷增大，蘆薈大黃素的最大轉(zhuǎn)化率為86.21%，當(dāng)體積酶活性大于50 U·mL-1時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率變化不大。

圖2 酶濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.2 Effects of enzyme＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.3 蘆薈苷質(zhì)量濃度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖3可知，當(dāng)蘆薈苷質(zhì)量濃度較低時，即低于100 g·L-1時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率變化不大，基本在80%左右。蘆薈苷在低質(zhì)量濃度下，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率較高，這是由于底物濃度低，葡萄糖苷酶水解速率較快，所以轉(zhuǎn)化率偏高;當(dāng)蘆薈苷質(zhì)量濃度高于100 g·L-1時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率迅速下降，由于葡萄糖苷酶的量有限，且達(dá)到最大水解速率，底物雖然增加，但蘆薈大黃素的產(chǎn)量不會隨之增加，因此呈下降趨勢?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)意義，選擇蘆薈苷質(zhì)量濃度為100 g·L-1作為最適底物質(zhì)量濃度。

圖3 蘆薈苷質(zhì)量濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.3 Effects of Aloin＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.4 叔丁醇與水的體積比對蘆薈大黃素合成的影響

由圖4可知，叔丁醇對葡萄糖苷酶水解蘆薈苷影響較大，可能是由于叔丁醇和水以一定比例混合時，蘆薈苷的溶解性較好，有利于蘆薈苷的水解。當(dāng)V(叔丁醇)∶V(水)=5∶5時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率最高，為84.09%。當(dāng)叔丁醇含量降低時，由于蘆薈苷溶解度下降，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率降低;當(dāng)叔丁醇含量較高時，叔丁醇會影響葡萄糖苷酶活力，使其活力降低，導(dǎo)致蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率降低。

圖4 叔丁醇濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.4 Effects of tert-butanol＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.5 溫度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)溫度低于50℃時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率隨著溫度的增高而增大。反應(yīng)溫度為50℃時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率最大，為85.78%，當(dāng)反應(yīng)溫度大于50℃時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率迅速降低。可能的原因是，一方面，由于反應(yīng)溫度較高，酶蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致酶活力喪失，影響蘆薈苷的水解，從而使蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率下降。

圖5 溫度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on the synthesize of Aloe-emodin

2.6 pH值對蘆薈大黃素合成的影響

由圖6可知，當(dāng) pH 值在3.6～5.2，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率逐漸增大，說明該葡萄糖苷酶不耐酸，在強(qiáng)酸條件下，該酶蛋白發(fā)生變性，致使蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率較低;當(dāng)pH值為5.2時，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率最大，為 85.08%，當(dāng) pH 值在 5.2 ～8.0，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率變化不大，說明該重組葡萄糖苷酶適宜在弱酸和弱堿性條件下反應(yīng)，具有廣泛的pH值適應(yīng)性。

圖6 pH值對蘆薈大黃素合成的影響Fig.6 Effects of pH on the synthesis of Aloe-emodin

2.7 響應(yīng)曲面試驗

利用Design Expert 7.1軟件對試驗因素和水平進(jìn)行設(shè)計，并通過試驗得到各自的蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表2。通過Design Expert 7.1軟件進(jìn)行回歸分析，得到蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率和各影響因素之間的回歸方程。擬合后得到反應(yīng)時間(X1)、叔丁醇與水的體積比(X2)、反應(yīng)溫度(X3)的二次回歸模型為:

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果Table 2 The design of response surface methodology and the results of test

由試驗因素與水平設(shè)計，共進(jìn)行了17次試驗，可分為析因子和零點(diǎn)，其中析因子共有12個，零點(diǎn)為區(qū)域中心，共有5個，用來估計試驗誤差。

由回歸分析方差表3可知，模型決定系數(shù)R2為0.999 6，F(xiàn) 值為1 302.38(P ＜0.000 1)，說明此模型極顯著，反應(yīng)時間(X1)、叔丁醇與水的體積比(X2)、反應(yīng)溫度(X3)對蘆薈苷水解效應(yīng)顯著。Lack of Fit值為0.11，即方程擬合度很高。信噪比Adeq Precision的值很高(為107.19)，即該模型可用于預(yù)測，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳糖苷合成條件。CV值 (即Y的變異系數(shù))表示試驗的精確度，CV值越高，則試驗的可靠性越低，本試驗中CV值為1.11%，比較低，表明試驗操作可靠。因此，該回歸方程可確定蘆薈大黃素的最佳合成工藝條件?；貧w模型方差分析(表4)中一次項 X1，X2，X3，二次項和交互項 X1X2，對模型均影響顯著，說明各因素對糖苷合成不是簡單的線性關(guān)系。

由回歸方程可分別得出反應(yīng)時間(X1)、叔丁醇濃度(X2)、反應(yīng)溫度(X3)3因素與蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率之間的響應(yīng)面圖，如圖7所示。由圖7可知反應(yīng)時間(X1)、叔丁醇與水體積比(X2)對蘆薈大黃素的合成影響較顯著，且各因素之間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致。

運(yùn)用Design Expert 7.1軟件，通過回歸方程得到蘆薈大黃素最佳合成工藝條件是:反應(yīng)時間為4 h，V(叔丁醇)∶V(水)=3.5∶6.5，反應(yīng)溫度為 43℃，蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率90.80%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

表4 回歸分析方差表Table 4 Table of regression analysis of variance

圖7 反應(yīng)時間和叔丁醇與水體積比對蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 The interaction effection of reaction time tert-butanol’s concentration

3 驗證試驗及其結(jié)果

稱取蘆薈苷10 g放入500 mL圓底燒瓶內(nèi)，依次加65 mL乙酸緩沖液(20 mmol·L-1，pH值5.2)，35 mL叔丁醇和5 mL β-葡萄糖苷酶粗酶液(50 μ·mL-1)，在 43 ℃，100 r·min-1條件下反應(yīng)4 h，重復(fù)2次。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)高效液相色譜法測得蘆薈大黃素轉(zhuǎn)化率分別為89.06%，89.42%，91.63%。3次試驗的蘆薈大黃素平均值為90.04%，與理論值90.80%相差0.6%。因此，該模型能較好地反映蘆薈大黃素最佳合成工藝條件，從而證明了響應(yīng)面分析設(shè)計方法在確定蘆薈大黃素最佳合成工藝條件的可行性。

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)曲面法分析了β-葡萄糖苷酶催化合成蘆薈大黃素的工藝。通過分析及試驗證明，當(dāng)叔丁醇與水的體積比為3.5∶6.5，β-葡萄糖苷酶的體積酶活性為50 μ·mL-1，在43℃，100 r·min-1條件下反應(yīng) 4 h，蘆薈大黃素的得率為90.04%。

［1］ 廖志華，談 鋒.蘆薈的藥理作用［J］.國外醫(yī)藥:植物藥分冊，1999，14(4):184-185.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)從出版社，2000:129.

［3］ VITTORI N，COLLINS M.Production of rhein and rhein derivatives:US，5652265［p］.1997

［4］ CARLINO，STEFANO，DI NAPOLI et al.Process for preparing aloe-emodin:US，7453004［p］.2005

［5］ S.卡里諾，G.迪納伯利.制備蘆薈大黃素的方法:CN，101104583A［p］.2007

［6］ 李建生，梁生旺，鄭曉珂，等.大黃素、蘆薈大黃素提取方法及其應(yīng)用:CN，1887837［P］.2007