韓孔艷，趙改名，高曉平，李苗云，柳艷霞，張秋會，趙莉君，孫靈霞，黃現(xiàn)青

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點試驗室，河南鄭州450002)

微生物是影響肉品貨架期的主要因素［1-2］。傳統(tǒng)食品工業(yè)采用的殺菌方法主要是熱殺菌，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)外諸多學(xué)者研究了一系列新的殺菌技術(shù)，如微波殺菌、輻照殺菌、超高壓處理等［3-6］，而熱殺菌因其成本低、安全系數(shù)高等優(yōu)點，依然是國內(nèi)肉制品企業(yè)最普遍應(yīng)用的殺菌方法［7］。大多數(shù)肉制品在生產(chǎn)過程中會受到一些非致病性芽孢桿菌、嗜熱菌和耐高溫微生物的污染［8］，即使經(jīng)過熱殺菌，一些嗜熱菌及強耐熱性芽孢仍會殘存于產(chǎn)品中［9-10］，典型的如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)及其芽孢。嗜熱脂肪芽孢桿菌是引起低酸性食品酸敗的主要菌種［11］，被作為驗證濕熱滅菌程序的生物指示劑［12］，熱刺激等不利環(huán)境條件易誘導(dǎo)其芽孢萌發(fā)，芽孢在食品中萌發(fā)、生長、繁殖的過程也會導(dǎo)致食品的腐?。?3］。為了徹底殺滅此類嗜熱菌及芽孢，理論上需要高強度的熱處理［14-15］，但這樣容易導(dǎo)致產(chǎn)品色澤、質(zhì)構(gòu)劣化，營養(yǎng)成分破壞［16］，目前國內(nèi)肉制品企業(yè)多采用巴氏殺菌及100℃以下的高溫殺菌。目前，國內(nèi)外關(guān)于100℃以下嗜熱菌熱失活情況的研究報道較少，因此探究嗜熱菌在100℃以下的熱失活規(guī)律具有重要意義。為此，本研究對嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)在70、80、90℃熱處理中心溫度下的失活規(guī)律進行了研究，初步建立了各溫度的熱失活模型，旨在為企業(yè)選擇恰當(dāng)?shù)臒釟⒕鷹l件提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC 7953，購自Mecconti菌株MrcroSwabs系列;營養(yǎng)肉湯(NB)、營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗器材

蒸汽壓力滅菌鍋HVE-50，日本HIRAYAMA公司;臺式恒溫震蕩器THZ-C，太倉市華美生化儀器廠;潔凈工作臺SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;渦旋振蕩器VORTEX-2GENIE，美國Scientific Industries公司;水浴鍋THZ-82，金壇市杰瑞爾電器有限公司;中心溫度計，美國Delta TRAK公司;生化培養(yǎng)箱SPX-1505H-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱處理菌液的準(zhǔn)備 將嗜熱脂肪芽孢桿菌擴增培養(yǎng)18 h，達到穩(wěn)定期，此時細菌的體積個數(shù)為108CFU·mL-1，取10 mL該增菌液加入90 mL蒸餾水中，震蕩均勻即得到體積個數(shù)為107CFU·mL-1的菌液。取1 mL此菌液于1.5 mL離心管中，熱處理備用。

1.3.2 熱處理 將離心管置于水浴鍋中，利用中心溫度計將菌液中心溫度分別控制在70、80、90℃，菌液達到設(shè)定的中心溫度后開始計時，到達設(shè)定的熱處理時間后結(jié)束計時取出離心管，熱處理后將離心管放在冰水中冷卻5 min。每個時間點取3個平行樣。

1.3.3 活細胞計數(shù) 參考6×6點樣法［17］，取100 μL菌液于1.5 mL滅菌的離心管(內(nèi)裝有900 μL滅菌蒸餾水)中，按1∶10進行倍比稀釋，選取4個合適的稀釋度，取10 μL點在倒有培養(yǎng)基的平板上進行微生物測定，每個稀釋度4個平行，每個樣品做3個平行。平板置于56℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，然后計數(shù)。

1.3.4 致死率計算

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel分別計算每個樣品微生物取對數(shù)值后的平均值［平均log()］，每個樣品微生物取平均值后的對數(shù)值(n)，微生物平均值的估計值(logA).

S.D:標(biāo)準(zhǔn)差

采用Origin 8.0軟件作圖并擬合生長曲線、熱失活曲線和升溫曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中心溫度熱處理0～60 min

在70、80、90℃3個中心溫度下，初步設(shè)定熱處理時間為0～60 min，每5 min為1個梯度，共12個梯度。菌液熱處理后的殘存菌數(shù)量及致死率如圖1、圖2所示。

由圖1、圖2可知，在70、80、90℃ 3個不同的中心溫度條件下，嗜熱脂肪芽孢桿菌的熱失活規(guī)律一致:在熱處理時間為5 min時，菌液濃度大幅降低，分別從初始的 7.53、7.68、7.45 個數(shù)量級下降到5.01、4.11、3.85 個數(shù)量級，相應(yīng)地，5 min 時致死率較高，分別為 33.42%、46.43%、48.33%;之后隨著熱處理時間的延長，細菌體積個數(shù)在很小范圍內(nèi)上下波動，到60 min時殘存菌數(shù)量分別為4.89、3.96、3.62 個數(shù)量級，致死率分別為35.02%、48.43%、51.38%，變化幅度不大。該規(guī)律與 JAN等［18］關(guān)于110、115、121 ℃ 3個溫度條件下嗜熱脂肪芽孢桿菌(ATCC10149)孢子的熱失活規(guī)律相一致。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因，可能是細菌在進入高溫環(huán)境的最初階段對環(huán)境的不適應(yīng)性導(dǎo)致其較多地死亡，但由于嗜熱脂肪芽孢桿菌本身是耐熱菌，適應(yīng)環(huán)境所需時間短，且在這短暫的閾值時間內(nèi)高溫誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，殘存的菌體也會轉(zhuǎn)變成芽孢，以上過程完成后菌液濃度基本不再變化。本試驗結(jié)果表明閾值時間在5 min之內(nèi)，故后續(xù)采用逐漸縮小熱處理時間范圍的方法，探究閾值時間的具體時間并初步建立這一時間的熱失活模型。

圖1 70、80、90℃熱處理0～60 min后的殘存菌數(shù)量Fig.1 The residual amount of 0 ～60 min at 70，80，90 ℃

圖2 70、80、90℃熱處理0～60 min后的致死率Fig.2 The death rate of 0～60 min at 70，80，90 ℃

2.2 不同中心溫度熱處理0～5 min

鑒于2.1的研究，將熱處理時間設(shè)定為0～5 min，梯度為1 min，試驗結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 70、80、90℃熱處理0～5 min后的殘存菌數(shù)量Fig.3 The residual amount of 0 ～5 min at 70，80，90 ℃

圖4 70、80、90℃熱處理0～5 min后的致死率Fig.4 The death rate of 0～5 min at 70，80，90 ℃

從圖3、圖4可以看出，熱處理時間為1 min時，70、80、90℃3個熱處理溫度下的菌液體積個數(shù)均已大幅降低，從初始的7.56個數(shù)量級分別下降到5.04、4.11、3.99 個數(shù)量級，相應(yīng)的致死率分別為 33.38%、45.68%、47.19%，之后菌液濃度基本穩(wěn)定不變。因此閾值時間僅在達到中心溫度后的1 min內(nèi)，為了得到更準(zhǔn)確的時間范圍，熱處理時間被縮短至1 min以內(nèi)。

2.3 不同中心溫度熱處理0～1 min

將熱處理時間設(shè)定為0～1 min，梯度為10 s，試驗結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 70、80、90℃熱處理0～1 min后的殘存菌數(shù)量Fig.5 The residual amount of 0 ～1 min at 70，80，90 ℃

由圖5、圖6可知，熱處理時間為10 s時，70、80、90℃ 3個熱處理溫度下的菌液濃度分別從初始的7.29、7.70、7.06 個數(shù)量級下降到5.09、4.64、3.62個數(shù)量級，相應(yīng)地致死率分別為30.15%、39.76%、48.91%，之后菌液濃度基本穩(wěn)定不變。由此推斷菌體失活及芽孢萌發(fā)等過程在菌液達到中心溫度之前已經(jīng)完成。

圖6 70、80、90℃熱處理0～1 min后的致死率Fig.6 The death rate of 0～1 min at 70，80，90 ℃

2.4 達到中心溫度前的熱處理結(jié)果

從離心管置入水浴鍋瞬間開始計時，首先測定了菌液達到不同中心溫度前的溫度變化，并利用Origin 8.0軟件中的Hill1模型擬合繪制了升溫曲線，如圖 7所示。擬合方程為 T=START+(START-END)×tn/(kn+tn)，各升溫曲線的具體擬合方程及擬合參數(shù)見圖7，70、80、90℃的判定系數(shù) R2分別為0.999 2、0.998 1、0.994 0。由圖7 可得，各溫度均能在150 s之內(nèi)完成升溫，菌液中心溫度達到70、80、90℃之前的0 ～40 s升溫非常迅速，40 s時分別達到 56.0、64.5、75.0 ℃，但不同溫度的升溫速率不同，90℃最高，80℃其次，70℃最低;之后各菌液中心溫度持續(xù)緩慢上升，升溫速率依然是90℃ ＞80℃ ＞70℃，最后完成升溫過程的時間順序恰好相反，70℃為90 s，80℃為110 s，而90℃為140 s。

根據(jù)達到中心溫度前各時間點的菌液殘存菌數(shù)量繪制出的失活曲線如圖8所示，各失活曲線均可用Origin 8.0軟件中的Exponential模型擬合，擬合方程為y=y0+A×exp(R0×t)，各模型具體擬合方程及擬合參數(shù)見圖8，70、80、90℃的判定系數(shù)R2分別為 0.982 9、0.952 9、0.994 4。由圖 8 可知，各溫度下的菌液濃度在0～40 s下降迅速，這與升溫曲線0～40 s升溫最迅速一致，40～90 s各溫度的菌液濃度仍持續(xù)下降，但下降速度較前40 s明顯降低，90 s之后，70℃的菌液濃度基本達到穩(wěn)定，80、90℃條件下的菌液濃度仍以較低的速率下降，到150 s時也都基本恒定。由此確定各菌液在達到中心溫度之前均已完成菌體失活、芽孢萌發(fā)、殘存菌體轉(zhuǎn)變成芽孢等變化，但對于各變化的發(fā)生機制仍有待進一步研究。

菌液達到各中心溫度前各時間點對應(yīng)的致死率見圖9，因變化幅度相對較大而無法擬合模型，但仍可看出其與升溫曲線具有基本相同的趨勢。0～80 s，升溫速率越快，相同時間點的溫度就越高，致死率也越高，因此企業(yè)要想提高殺菌效率，除了傳統(tǒng)的升高殺菌溫度方法外，加快升溫速率也是關(guān)鍵。殘存菌數(shù)量達到穩(wěn)定值時，70、80、90℃的致死率分別為31.73%、40.07%、51.07%，溫度越高致死率越高。

圖7 達到各中心溫度前的升溫曲線Fig.7 The heating curves of 70，80，90 ℃ before reaching the center temperature

圖8 達到各中心溫度前的失活曲線Fig.8 The inactivation curves of 70，80，90 ℃ before reaching the center temperature

圖9 達到各中心溫度前的致死率Fig.9 The death rate of 70，80，90 ℃ before reaching the center temperature

綜上表明，嗜熱脂肪芽孢桿菌菌液在進行不同溫度熱處理時，達到中心溫度之前的短暫時間(150 s)內(nèi)即會形成一定數(shù)量的芽孢。肉制品經(jīng)過巴氏殺菌及100℃以下高溫殺菌之后仍有嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢殘存，且殘存菌數(shù)量不會隨著殺菌時間的延長而降低。該結(jié)果與傳統(tǒng)觀念上的熱殺菌時間越長，殺菌效果越好不符。這可能是由于高溫惡劣條件誘導(dǎo)了芽孢快速萌發(fā)，但萌發(fā)機制仍有待深入研究。

3 結(jié)論

嗜熱脂肪芽孢桿菌 ATCC7953在70、80、90℃不同熱處理中心溫度下，具有相同的失活規(guī)律:菌液在達到中心溫度之前，濃度即降低至一個穩(wěn)定值，此時致死率分別為 31.73%、40.07%、51.07%，之后隨著加熱時間的延長至60 min，菌液濃度基本保持不變;各溫度升溫過程中細菌的熱失活模型均可用 Exponential模型擬合，70、80、90℃的判定系數(shù) R2分別為 0.982 9、0.952 9、0.994 4。該研究結(jié)果可為企業(yè)優(yōu)化熱殺菌條件、提高熱殺菌效率及保障食品安全提供理論支持。

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