鄧培淵，王國霞，王 輝，李玉華，李長看

(1.鄭州師范學(xué)院，河南鄭州450044;2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000)

核型多角體病毒(Nucleopolyhedro viruses，NPVs)是一類廣泛用于害蟲生物防治的桿狀病毒。根據(jù)其分子親緣關(guān)系和是否含有包膜糖蛋白GP64，分為I型和 II型2個組［1］。其中鱗翅目昆蟲的核型多角體病毒屬于II型桿狀病毒，在這類病毒的基因組中普遍存在一種P13基因［2-5］，不僅在病毒侵染昆蟲細胞的過程中持續(xù)表達，而且對下游基因的表達也有負調(diào)控作用［6］。研究還發(fā)現(xiàn)，P13蛋白是一類與病毒殺蟲活性相關(guān)的蛋白，但對其殺蟲作用的分子機理尚不明確［7］。生長阻遏肽(Growth blocking peptide，GBP)是存在于昆蟲血淋巴中的一類多肽，已從黏蟲Mythimna(Leucania)separata、甘藍夜蛾Mamestra brassicae和斜紋夜蛾Spodoptera litura等多種鱗翅目昆蟲中分離鑒定出來［8-11］。GBP主要參與幼蟲的生長調(diào)節(jié)、細胞增殖和免疫細胞的調(diào)節(jié)［12］，但高濃度的GBP也會阻礙幼蟲的生長［13-14］，且GBP結(jié)合蛋白(GBP-binding protein，GBPBP)對 GBP 也有抑制活性［15］。既然P13蛋白和GBP結(jié)合蛋白在鱗翅目昆蟲幼蟲中同時出現(xiàn)，它們與核型多角體病毒的殺蟲機理是否有關(guān)。本研究以模式昆蟲家蠶Bombyx mori Linnaeus為試驗材料，在克隆家蠶GBPBP的基礎(chǔ)上，測定了其與P13蛋白之間是否存在互作關(guān)系，為深入研究GBPBP蛋白的功能和作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

家蠶品系為大造P50，由西南大學(xué)惠贈;Trizol提取試劑盒購自Gibco公司;病毒基因組提取試劑盒和His，GST標簽融合蛋白雜交試劑盒購自天根生化科技有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司;限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;pfu DNA聚合酶、T4 ligase酶和PageRular Prestained Protein Ladder購自 Ferments公司;pMD18-T購自 Takara公司;黏蟲核型多角體病毒(LsNPV)、表達載體pET-32a(+)，pGEX-6P1，菌株 DH10B、菌株 BL21(DE3)為鄭州市生物物種資源研究重點實驗室保存;GST和His親和柱材料為Whatman產(chǎn)品。

1.2 P13相互作用肽的篩選及序列分析

通過篩選噬菌體十五肽文庫，獲得與黏蟲核型多角體病毒P13蛋白(LsP13)相互作用的十五肽序列，并在NCBI上比對查找與其同源性較高的昆蟲蛋白序列。

1.3 RNA提取及基因克隆

取3～5齡的家蠶幼蟲，用無菌針頭刺破腹足，吸取約10 μL血淋巴液，加入到100 μL Trizol中;總RNA的提取及cDNA第1條鏈的合成依據(jù)試劑盒說明書進行。

通過在GenBank查找家蠶生長阻遏肽結(jié)合蛋白(BmGBPBP，DQ306881)和 LsP13(U30303)基因的CDS區(qū)，兩端加酶切位點和保護堿基，設(shè)計引物CAGTCATTC-3';BmGBP2(-):5'-AATGTCGACTG CCACGGCTGGATTATGA-3';LsP13(+):5'-GG-

GAATTCATGTTCGCGTTCGTAACT-3';LsP13(-):下劃線代表酶切位點序列，酶切位點前端為保護堿基。

1.4 融合表達載體的構(gòu)建

取提取的家蠶RNA 1 μg，按照Sigma cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第1條cDNA鏈，擴增BmGBPBP。由于病毒的基因組中不存在內(nèi)含子，所以LsP13的序列直接從LsNPV的基因組中進行擴增，病毒基因組的提取用天根病毒核酸提取試劑盒，方法按說明書進行。擴增的基因純化后與pMD18-T連接，經(jīng)測序鑒定后雙酶切，并與經(jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-32a(+)和pGEX-6P1連接，分別構(gòu)建 pET/32a-BmGBPBP/His和 pGEX-6P1-LsP13/GST融合表達載體，經(jīng)藍白斑篩選后送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 融合蛋白的誘導(dǎo)表達和預(yù)處理

將鑒定正確的pET/32a-BmGBBP和pGEX-6P1-LsP13質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)中，擴大培養(yǎng)至OD值為0.6，加入 IPTG至終濃度為0.4 mmol·L-1，于30℃誘導(dǎo)表達;誘導(dǎo)3 h后依次進行如下處理:1)5 000 r·min-1離心5 min，收集菌體;使用PBS(pH7.4)(含1%的Triton X-100和蛋白酶抑制劑)重懸;2)超聲破碎后離心取上清，將上清通過0.45 μm的針頭濾器，加入親和層析柱，使其在室溫下緩慢通過;3)再用5倍層析柱體積的PBS溶液洗滌柱子，重復(fù)3次;4)加入洗脫液(PBS+150 mmol·L-1咪唑)孵育。

1.6 GST Pull down

將誘導(dǎo)后的LsP13/GST融合蛋白的上清液與GST親和層析柱孵育后，用5倍柱體積的PBS溶液洗滌5次，取3 μL柱材料作為對照1，用于檢測LsP13/GST融合蛋白與柱子的結(jié)合;將BmGBPBP/His融合蛋白的上清加入到結(jié)合LsP13/GST融合蛋白的親和層析柱中孵育1 h，同時向空白的GST親和層析柱中加入等量的BmGBPBP/His融合蛋白上清液作為對照。孵育結(jié)束后加入5倍柱子體積的PBS溶液清洗柱子，洗滌結(jié)束后取3 μL柱材料，與對照1共同進行SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測。

1.7 Western免疫印跡檢測

待檢測樣品從SDS-PAGE膠上電轉(zhuǎn)至NC膜上，PBST+5%脫脂牛奶封閉1 h;加GST或His一抗(稀釋度1∶1 000)孵育1 h，PBST洗膜3次;加入AP(堿性磷酸酶)標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶2 500)，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次;最后將NC膜置于BCIP/NBT顯色液中至條帶顯色清晰，ddH2O終止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶BmGBPBP基因和LsNPV P13基因的克隆

以家蠶總RNA為模板進行一步法反轉(zhuǎn)錄PCR，PCR后通過瓊脂糖凝膠鑒定，得到單一條帶(圖1)。切膠回收后與pMD18-T載體連接，挑取白色單克隆測序。

圖1 BmGBPBP基因的反轉(zhuǎn)錄RT-PCR結(jié)果Fig.1 Reverse transcription PCR product of BmGBPBP gene

選擇測序正確的克隆提取質(zhì)粒，用BamHI和SalI酶切后回收，得到約1.2 kb的目的條帶;原核表達載體pET32a(+)用同樣的酶進行酶切后回收，用T4連接酶連接后4℃過夜。

圖2 LsP13基因反轉(zhuǎn)錄RT-PCR結(jié)果Fig.2 Result of reverse transcription PCR product of LsP13gene

LsP13以LsNPV的基因組為模板進行擴增，得到約900 bp片段，如圖2所示。從圖3可以看出，得到P13基因的全長后連接到pMD18-T，雙酶切EcoRI和XhoI位點連接到原核表達載體pGEX-6P1的相同位點，說明測序驗證正確。

2.2 LsP13/GST和BmGBPBP/His融合蛋白的表達分析

取未誘導(dǎo)的pGEX-6P1-LsP13的BL21(DE3)菌液作為對照，以及IPTG誘導(dǎo)的全菌和超聲波破碎后的上清進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，重組載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生1條55 kD左右的特異性條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組載體則無此條帶，且目的蛋白存在于超聲破碎后的上清液中。

圖3 pGEX-6P1-LsP13表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed pGEX-6P1-LsP13

2.3 BmGBPBP/His融合蛋白的表達

圖4 pET/32a-BmGBPBP表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of expressed pGEX-6P1-LsP13

取未誘導(dǎo)的pET/32a-BmGBPBP的BL21(DE3)菌液作為對照，對IPTG誘導(dǎo)的全菌和超聲波破碎后的上清進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4所示。從圖 4可以看出，pET/32a-BmGBPB經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生1條75 kD左右的特異性條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組載體則無此條帶，且超聲破碎后目的蛋白也存在于上清液中。

2.4 GST Pull down檢測 LsP13與 BmGBPBP的相互作用

采用 GST Pull down來檢測 LsP13蛋白與BmGBPBP蛋白的相互作用，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，BmGBPBP/His融合蛋白不能結(jié)合到空白的GST親和柱上，但可以與LsP13/GST蛋白的親和柱結(jié)合。

圖5 GST Pull down結(jié)果SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of GST Pull down product

為了證實親和柱結(jié)合的蛋白是否為LsP13/GST和BmGBPBP/His融合蛋白，對PAGE膠上的蛋白進行Western blot檢測，孵育一抗的同時加入抗GST和His標簽的單抗，得到圖6結(jié)果。從圖6可以看出，Pull down結(jié)果以及His和GST單抗都發(fā)生了特異性反應(yīng)，證明2種蛋白間存在相互作用。

圖6 Western印跡分析LsP13/GST和BmGBPBP/His的Pull down結(jié)果Fig.6 Western blotting analysis of Pull down product of LsP13/GST and BmGBPBP/His

3 討論

P13基因特異性的存在于桿狀病毒 II型中［2］。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，P13基因在II型棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)中為非必須基因，但被敲除后病毒的殺蟲能力明顯下降，說明其表達的P13蛋白可能是與殺蟲有關(guān)的正調(diào)控因子［7］。已有研究表明，P13基因在Sf9細胞中的表達可以明顯抑制多角體的產(chǎn)生，其抑制效果隨P13基因表達時相的提前而加強，且明顯增加出芽病毒(BV)的產(chǎn)生，表明P13蛋白提前殺蟲效果的機制是由于P13蛋白改變了BV與多角體之間的動態(tài)平衡［5］。這些研究結(jié)果暗示，P13基因可能是一個與殺蟲相關(guān)的基因，但至今缺乏在分子水平上的證據(jù)。

本研究通過比對LsGBPBP蛋白序列，發(fā)現(xiàn)家蠶BmGBPBP蛋白與LsGBPBP蛋白有著較高的同源性，因此選擇了BmGBPBP作為研究對象。但由于目前對昆蟲GBP及其結(jié)合蛋白GBPBP的研究較少，已有的相關(guān)研究大多集中于對哺乳動物的同源蛋白進行比較［13，15］，而有關(guān) GBPBP 與昆蟲病毒蛋白的相互作用研究還未見報道，所以本研究通過體外的Pull down試驗來證實GBPBP蛋白與昆蟲病毒LsP13蛋白的相互作用，雖然研究結(jié)果不能作為其生理功能的直接證據(jù)，但可為最終闡明其作用機制提供理論參考。

前人的研究發(fā)現(xiàn)，黏蟲的LsGBP具有刺激昆蟲免疫血細胞、調(diào)控幼蟲生長、影響細胞增殖和誘導(dǎo)其他血細胞溶血等功能，類絳色細胞中的GBPBP蛋白與GBP分子結(jié)合后，可引起這類細胞的裂解［12］。對家蠶GBPBP蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染后蠶體GBPBP的表達量會有所上升，但是也有相反的報道，GBPBP蛋白的表達量上升不是病毒感染，而是由于細菌感染所致［15-16］?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測P13蛋白與GBPBP蛋白相互作用，可能影響了GBP作用于血細胞的免疫反應(yīng)或溶血反應(yīng)。這些研究為進一步闡明桿狀病毒的殺蟲機制提供了新的啟示。

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