梁春輝，張寒，任連新

(1.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710083;2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021;3.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 051430)

山竹花(Disporam cantoniense (Lour.)Merr.)別名萬(wàn)壽竹、豪豬七、白毛七、竹葉參等，產(chǎn)于秦嶺北坡甘肅天水的小隴山、陜西太白山及南坡之略陽(yáng)、佛坪、寧陜和甘肅、成諸縣等。山竹花生長(zhǎng)海拔高度700 ～3 000 m，多見(jiàn)山坡灌叢中或林下草地，喜肥沃而濕潤(rùn)的腐殖土。其以根及根莖入藥，性寒味甘，具有清熱解毒、舒筋活血之功效，民間常將其用于治療痛經(jīng)、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、骨折等癥［1-2］。

目前，國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道山竹花中含有蘆丁、木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷等黃酮類(lèi)成分［3］。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)山竹花中黃酮類(lèi)含量測(cè)定的相關(guān)記載，本文在參考了大量有關(guān)山竹花和黃酮類(lèi)化合物提取分離及含量測(cè)定的文獻(xiàn)資料后，分別以蘆丁和木犀草素為對(duì)照品對(duì)山竹花進(jìn)行了不同部位(葉、莖、根)中蘆丁和木犀草素的含量測(cè)定。另外，由于山竹花中含有木犀草素-7-Oβ-D-葡萄吡喃糖苷等苷類(lèi)成分，而苷類(lèi)在酸性條件下易發(fā)生水解，本文在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將用于測(cè)定木犀草素的樣品溶液進(jìn)行酸處理，再次測(cè)定該樣品中木犀草素的含量，并與未經(jīng)酸處理的樣品測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行了比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

蘆丁對(duì)照品(HPLC 檢測(cè)用，純度≥98%);木犀草素對(duì)照品(HPLC 檢測(cè)用，純度≥98%);甲醇，色譜純;其它試劑均為分析純;山竹花采自秦嶺太白山，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定為百合科山竹花。

Agilent 1260 高效液相色譜儀;Thermo C18柱色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);KQ-300B 型超聲波清洗器;GR-202 型分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

1.2.1.1 蘆丁 色譜柱:Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(38∶62);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm。在此色譜條件下，蘆丁分離度較好［4-8］，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照液色譜圖Fig.1 Rutin control the liquid chromatogram

1.2. 1. 2 木犀 草素 色 譜柱:Thermo C18柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。在此色譜條件下，木犀草素分離度較好［9-10］，見(jiàn)圖2。

圖2 木犀草素對(duì)照液色譜圖Fig.2 Luteolin control liquid chromatogram

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制

1.2.2.1 蘆丁對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)定蘆丁對(duì)照品3.9 mg，以60%乙醇并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含蘆丁0. 39 mg 的對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 木犀草素對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)定木犀草素對(duì)照品3.4 mg，以100%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含木犀草素0.34 mg 的對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

1.2.3.1 蘆丁供試品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取山竹花根、莖、葉粉末5 g(各3 份，編號(hào)a、b、c、d、e、f)，置于500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 蒸餾水，沸水煎煮1 h，過(guò)濾，所余藥渣加100 mL 蒸餾水繼續(xù)煎煮45 min，合并兩次煎液，用四層紗布過(guò)濾，抽濾，將所得濾液水浴蒸干，以60%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，定容即得蘆丁供試品溶液。

1.2.3.2 木犀草素供試品溶液(Ⅰ)的配制 分別精密稱(chēng)取山竹花根、莖、葉粉末5 g(各3 份，編號(hào)a、b、c、d、e、f)，將其置于500 mL 索氏提取器中，向內(nèi)加入200 mL 石油醚，浸泡12 h 后，70 ℃水浴加熱提取至無(wú)色，放置至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸干石油醚，加甲醇100 mL，超聲提取30 min，將甲醇水浴蒸干，以100%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，定容即得木犀草素供試品溶液(Ⅰ)。

1.2.3.3 木犀草素供試品溶液(Ⅱ)的配制 分別精密量取木犀草素供試品溶液(Ⅰ)中9 份溶液200 μL，向其中各加入1 滴稀硫酸溶液，搖勻后靜置10 min，即得木犀草素供試品溶液(Ⅱ)。

1.2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取1.2.2、1.2.3 節(jié)配制所得的對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按1.2.1 節(jié)色譜條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 蘆丁 分別吸取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL 注入高效液相色譜儀，按照1.2.1.1 節(jié)色譜條件測(cè)定，結(jié)果在供試品中蘆丁與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且能達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖3。

圖3 山竹花樣品色譜圖Fig.3 Sample chromatogram

2.1.2 木犀草素 分別吸取木犀草素對(duì)照品溶液、供試品溶液(Ⅰ)(Ⅱ)20 μL，注入高效液相色譜儀，按照1.2.1.2 節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在供試品中木犀草素與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且能達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖4。

圖4 山竹花樣品色譜圖Fig.4 Sample chromatogram

2.2 線性關(guān)系的考察

2.2.1 蘆丁 精密量取1.2.2 節(jié)蘆丁對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL 至5 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁線性回歸方程為Y =16 232X +47.054，r=0.999 7(n=5)。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在0.007 8 ～0.124 8 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.2 木犀草素 精密量取1.2.2 節(jié)木犀草素對(duì)照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 至5 mL 容量瓶中，用100%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素回歸方程為Y =12 040X+11.358，r=0.999 1(n =5)。結(jié)果表明，木犀草素進(jìn)樣量在0.003 4 ～0.054 4 mg/mL 范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取1.2.2 節(jié)蘆丁、木犀草素對(duì)照品溶液各6 份(20 μL)，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果蘆丁RSD 為0.003 5%，木犀草素RSD 為0.034 9%，表明二者重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取蘆丁、木犀草素對(duì)照品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 各進(jìn)樣20 μL，分別測(cè)定兩者的峰面積。結(jié)果蘆丁RSD 為0.002 5%，木犀草素RSD為1.48%，表明二者均在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的山竹花葉b、e 供試品溶液各3份，精密量取b 溶液1 mL，加入蘆丁對(duì)照品溶液100 μL;量取e 溶液400 μL，加入木犀草素對(duì)照品溶液100 μL，分別混勻即得供試樣品。分別量取以上兩種溶液各20 μL 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各自加樣回收率。結(jié)果蘆丁加樣平均回收率為97.51%，RSD 為0.13%;木犀草素加樣平均回收率為96.03%，RSD為0.54%。表明該樣品制備方法準(zhǔn)確性較高，可靠性較強(qiáng)。

2.6 樣品測(cè)定

精密量取1. 2. 3 節(jié)制得的供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算各成分含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果Table 1 Disporam cantoniense(Lour.)Merr.samples for the determination of results

由表1 可知，山竹花葉中蘆丁含量最高，木犀草素葉中含量比莖中高，根中木犀草素未檢出，經(jīng)酸處理過(guò)的樣品溶液中木犀草素比沒(méi)有處理過(guò)的含量高。

3 結(jié)論

(1)在參考文獻(xiàn)［4-8］中，蘆丁的檢測(cè)波長(zhǎng)為368，358，510 nm，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在358 nm 處蘆丁的峰型和峰面積均十分理想，故本實(shí)驗(yàn)采用358 nm 對(duì)蘆丁進(jìn)行檢測(cè)。

(2)在參考文獻(xiàn)［9-10］中木犀草素的檢測(cè)波長(zhǎng)為283，350 nm，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在350 nm 處木犀草素的峰型和峰面積均十分理想。故本實(shí)驗(yàn)采用350 nm對(duì)木犀草素進(jìn)行檢測(cè)。

(3)本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，分別建立測(cè)定山竹花藥材中蘆丁、木犀草素的含量的方法，所用方法靈敏、簡(jiǎn)單易行，專(zhuān)屬性、重復(fù)性、回收率均符合要求。

(4)對(duì)比木犀草素樣品溶液(Ⅰ)、(Ⅱ)的結(jié)果可以看出，經(jīng)酸處理過(guò)的樣品溶液中木犀草素含量更高，說(shuō)明山竹花中的黃酮苷類(lèi)成分在酸性條件下發(fā)生了水解，從而測(cè)得樣品中木犀草素的含量升高。

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