姚軍，武鈺，張煌濤，李東雨，鹿毅，李莉

(1.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830004;2.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)是世界最大的棉花生產(chǎn)國(guó)，其面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)量均居世界首位［1-2］，新疆是我國(guó)重要的棉花主產(chǎn)區(qū)，2014 年棉花產(chǎn)量為367. 7 萬(wàn)t，約占全國(guó)棉花總產(chǎn)量的59.7%［3］。棉酚是一種從陸地棉根、莖、葉、種子中提取得到的多元酚類(lèi)物質(zhì)，又稱棉籽醇，集中在棉籽仁的球狀色腺體中，是一種姜黃色無(wú)氣味的多酚色素，在棉籽中的含量為0.15% ～1.8%，占棉仁質(zhì)量的1.5% ～2.7%［4］。棉酚的存在形式有2 種，為游離棉酚和結(jié)合棉酚。其中游離棉酚對(duì)人體的大部分臟器都有損害，對(duì)生殖系統(tǒng)和對(duì)腎臟的危害最大［5］，引起男性精子數(shù)和睪丸體積減少，導(dǎo)致女性閉經(jīng)、子宮萎縮、子宮肌瘤和功能性子宮出血［6］。

棉酚化學(xué)性質(zhì)非常不穩(wěn)定，在放置過(guò)程中極易發(fā)生降解，當(dāng)棉酚進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，大部分棉酚會(huì)排出體外，部分會(huì)蓄積在肝、腎等器官中。另外，棉酚會(huì)在體內(nèi)發(fā)生代謝，產(chǎn)物主要為其氧化產(chǎn)物gossypolone(6，6＇，7，7＇-四羥基-5，5＇-二異丙基-3，3＇-二甲基-［2，2＇］-聯(lián)萘-1，1＇，4，4＇-四酮基-［8，8］-二甲醛，分子式C30H26)，具有較強(qiáng)的毒性。目前對(duì)該氧化產(chǎn)物研究較少，無(wú)法購(gòu)買(mǎi)到對(duì)照品。

本實(shí)驗(yàn)以游離棉酚為反應(yīng)物，利用FeCl3氧化制備gossypolone，考察了反應(yīng)條件，利用質(zhì)譜方法進(jìn)行表征，并進(jìn)行了純度測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲酸均為色譜純;六水合三氯化鐵、丙酮、乙醚、硫酸、冰乙酸均為優(yōu)級(jí)純;棉酚(純度≥98%)。

TSQ Quantum 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀;Xevo G2-S QTOF MS 飛行時(shí)間液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀;Agilent1220 高效液相色譜儀;RE-5203 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;BS124S 電子天平;KQ5200 超聲波清洗器;Milli-Q Gradient 純水器;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋;DHG-9123 熱風(fēng)循環(huán)烘箱。

1.2 gossypolone 的制備

精密稱取0.200 2 g 棉酚置于100 mL 圓底燒瓶中，加入冰乙酸、丙酮及10%FeCl3·6H2O 水溶液各20，10，15 mL，邊加邊攪拌，混合均勻后，將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋上回流加熱，冷卻，加入25 mL 蒸餾水。將黑褐色混合液轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗中，加入乙醚和20%硫酸溶液各60 mL，搖勻，使析出的氧化產(chǎn)物溶解在乙醚層中，靜置，分層，棄去下層水溶液，將上層溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 圓底燒瓶中，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去乙醚，將黑褐色物質(zhì)置于蒸發(fā)皿上，干燥，得黑褐色粉末，－20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.3 gossypolone 表征

1.3.1 準(zhǔn)確分子量的測(cè)定 精密稱取10 mg 棉酚氧化產(chǎn)物置于100 mL 容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，得濃度為100 μg/mL 的棉酚氧化產(chǎn)物儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL 置于10 mL 棕色容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液定容至刻度，搖勻，得濃度為10 μg/mL 的棉酚氧化產(chǎn)物供試品溶液。

ESI-QTOF/MS 條件:在負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度280 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量1 L/h，錐孔電壓40 V，流動(dòng)相為乙腈∶0.5%甲酸=75 ∶25，流速0.2 mL/min。脫溶劑氣、霧化氣和錐孔氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣。通過(guò)IntelliStart(MassLynx 4.1 的一個(gè)內(nèi)嵌軟件)用0.5 mmol 的甲酸鈉校正質(zhì)量軸至誤差小于1 ×10－6。m/z 測(cè)定范圍為100 ～1 200，供試品溶液經(jīng)0.22 nm 微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。

1.3.2 特征碎片離子檢測(cè) 采用TSQ Quantum 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行特征碎片離子的檢測(cè)，色譜柱 YMC-Pack ODS-AM (150 mm × 3. 0 mm，3 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶1% 甲酸= 90 ∶10，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)，其他質(zhì)譜條件待優(yōu)化。

1.3.3 純度測(cè)定 采用HPLC 測(cè)定，色譜柱YMCPack ODS-AM(150 mm ×3.0 mm，3 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶1% 甲酸=85 ∶15，流速0. 5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 氧化劑FeCl3·6H2O 水溶液加入方式的選擇 FeCl3·6H2O 水溶液在氧化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，根據(jù)文獻(xiàn)中的方法［8］，需在棉酚與冰乙酸、丙酮混合液一同加熱的過(guò)程中加入FeCl3·6H2O 水溶液，由于棉酚的熱不穩(wěn)定性，需對(duì)此方法進(jìn)行優(yōu)化。

FeCl3·6H2O 水溶液加入棉酚與冰乙酸、丙酮混合液的方式有3 種:①先加入后加熱;②先加熱后加入;③先加入一半體積量，回流加熱時(shí)再加入另一半體積量。結(jié)果表明，3 種方法都能制備得到氧化產(chǎn)物，產(chǎn)率分別為91.06%，83.62%，89.21%，純度分別為95. 6%，88. 9%，93. 4%，即采用先加入FeCl3·6H2O 水溶液，后進(jìn)行冷凝回流加熱的方法為好。

2.1.2 回流加熱溫度的選擇 對(duì)回流加熱的溫度進(jìn)行考察。結(jié)果表明，80，90，100 ℃三個(gè)不同溫度制備得到的氧化產(chǎn)物的純度分別為82. 9%，94.6%，88. 4%，產(chǎn) 率 分 別 為83. 5%，90. 2%，92.3%。由于后續(xù)實(shí)驗(yàn)需對(duì)氧化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和拆分，要求其具有較高的純度，故選擇回流加熱溫度為90 ℃。

2.2 準(zhǔn)確分子量的測(cè)定

經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)，［M-H］－m/z 545.144 2的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 棉酚氧化產(chǎn)物gossypolone 樣品QTOF MS 質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum by QTOF MS of gossypolone

由圖1 可知，氧化產(chǎn)物M 的準(zhǔn)確分子量為546.152 0;而 gossypolone 分 子 量 理 論 值 為546.151 8，說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物與gossypolone 分子量吻合很好。

2.3 特征碎片離子

對(duì)氧化產(chǎn)物進(jìn)行ESI 正、負(fù)離子的一級(jí)質(zhì)譜全掃描，在正、負(fù)離子模式下均有特征離子峰，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力3 500 kPa，輔氣壓力1 750 kPa，毛細(xì)管溫度350 ℃，反吹壓力175 kPa，錐孔電壓2 100 kPa。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，得到3 個(gè)響應(yīng)較高的氧化產(chǎn)物的碎片離子，m/z 分別為273. 1，244. 2，257.3，這3 個(gè)特征離子的產(chǎn)生均可由gossypolone 裂解產(chǎn)生，碎片離子質(zhì)譜圖及裂解途徑見(jiàn)圖2。

圖2 碎片離子質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 Fragment ion mass spectra and fragmentation pathways

2.4 gossypolone 純度

gossypolone HPLC 分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 gossypolone 樣品溶液HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of gossypolone sample solution

由圖3 可知，gossypolone 的保留時(shí)間為4.250 min，用面積歸一法計(jì)算得出gossypolone 的純度為95.7%。

3 結(jié)論

(1)以棉酚為原料，采用半合成法制備棉酚氧化產(chǎn)物gossypolone 的適宜條件為:先加入FeCl3·6H2O 水溶液后進(jìn)行冷凝回流加熱，回流加熱溫度為90 ℃，產(chǎn)率90.2%。

(2)采用EIS-QTOF/MS 飛行時(shí)間質(zhì)譜和LCMS/MS 對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，確定制得的化合物為gossypolone，純度95.7%。

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