姚軍，武鈺，張煌濤，李東雨，鹿毅，李莉

(1.新疆產品質量監(jiān)督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004;2.新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830054)

棉花是我國重要的經濟作物，我國是世界最大的棉花生產國，其面積、單產和總產量均居世界首位［1-2］，新疆是我國重要的棉花主產區(qū)，2014 年棉花產量為367. 7 萬t，約占全國棉花總產量的59.7%［3］。棉酚是一種從陸地棉根、莖、葉、種子中提取得到的多元酚類物質，又稱棉籽醇，集中在棉籽仁的球狀色腺體中，是一種姜黃色無氣味的多酚色素，在棉籽中的含量為0.15% ～1.8%，占棉仁質量的1.5% ～2.7%［4］。棉酚的存在形式有2 種，為游離棉酚和結合棉酚。其中游離棉酚對人體的大部分臟器都有損害，對生殖系統(tǒng)和對腎臟的危害最大［5］，引起男性精子數(shù)和睪丸體積減少，導致女性閉經、子宮萎縮、子宮肌瘤和功能性子宮出血［6］。

棉酚化學性質非常不穩(wěn)定，在放置過程中極易發(fā)生降解，當棉酚進入動物體內，大部分棉酚會排出體外，部分會蓄積在肝、腎等器官中。另外，棉酚會在體內發(fā)生代謝，產物主要為其氧化產物gossypolone(6，6＇，7，7＇-四羥基-5，5＇-二異丙基-3，3＇-二甲基-［2，2＇］-聯(lián)萘-1，1＇，4，4＇-四酮基-［8，8］-二甲醛，分子式C30H26)，具有較強的毒性。目前對該氧化產物研究較少，無法購買到對照品。

本實驗以游離棉酚為反應物，利用FeCl3氧化制備gossypolone，考察了反應條件，利用質譜方法進行表征，并進行了純度測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲酸均為色譜純;六水合三氯化鐵、丙酮、乙醚、硫酸、冰乙酸均為優(yōu)級純;棉酚(純度≥98%)。

TSQ Quantum 三重四極桿液質聯(lián)用儀;Xevo G2-S QTOF MS 飛行時間液相色譜質譜/質譜聯(lián)用儀;Agilent1220 高效液相色譜儀;RE-5203 旋轉蒸發(fā)儀;BS124S 電子天平;KQ5200 超聲波清洗器;Milli-Q Gradient 純水器;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋;DHG-9123 熱風循環(huán)烘箱。

1.2 gossypolone 的制備

精密稱取0.200 2 g 棉酚置于100 mL 圓底燒瓶中，加入冰乙酸、丙酮及10%FeCl3·6H2O 水溶液各20，10，15 mL，邊加邊攪拌，混合均勻后，將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋上回流加熱，冷卻，加入25 mL 蒸餾水。將黑褐色混合液轉移至250 mL 分液漏斗中，加入乙醚和20%硫酸溶液各60 mL，搖勻，使析出的氧化產物溶解在乙醚層中，靜置，分層，棄去下層水溶液，將上層溶液轉移至50 mL 圓底燒瓶中，采用旋轉蒸發(fā)儀揮去乙醚，將黑褐色物質置于蒸發(fā)皿上，干燥，得黑褐色粉末，－20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.3 gossypolone 表征

1.3.1 準確分子量的測定 精密稱取10 mg 棉酚氧化產物置于100 mL 容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，得濃度為100 μg/mL 的棉酚氧化產物儲備液。精密吸取儲備液1 mL 置于10 mL 棕色容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液定容至刻度，搖勻，得濃度為10 μg/mL 的棉酚氧化產物供試品溶液。

ESI-QTOF/MS 條件:在負離子模式下進行檢測，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度280 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量1 L/h，錐孔電壓40 V，流動相為乙腈∶0.5%甲酸=75 ∶25，流速0.2 mL/min。脫溶劑氣、霧化氣和錐孔氣為氮氣，碰撞氣為氬氣。通過IntelliStart(MassLynx 4.1 的一個內嵌軟件)用0.5 mmol 的甲酸鈉校正質量軸至誤差小于1 ×10－6。m/z 測定范圍為100 ～1 200，供試品溶液經0.22 nm 微孔濾膜過濾，進樣。

1.3.2 特征碎片離子檢測 采用TSQ Quantum 三重四極桿液質聯(lián)用儀進行特征碎片離子的檢測，色譜柱 YMC-Pack ODS-AM (150 mm × 3. 0 mm，3 μm)，流動相為乙腈∶1% 甲酸= 90 ∶10，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，選擇性反應監(jiān)測(SRM)，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)，其他質譜條件待優(yōu)化。

1.3.3 純度測定 采用HPLC 測定，色譜柱YMCPack ODS-AM(150 mm ×3.0 mm，3 μm)，流動相為乙腈∶1% 甲酸=85 ∶15，流速0. 5 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長235 nm。

2 結果與討論

2.1 制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 氧化劑FeCl3·6H2O 水溶液加入方式的選擇 FeCl3·6H2O 水溶液在氧化過程中起關鍵作用，根據文獻中的方法［8］，需在棉酚與冰乙酸、丙酮混合液一同加熱的過程中加入FeCl3·6H2O 水溶液，由于棉酚的熱不穩(wěn)定性，需對此方法進行優(yōu)化。

FeCl3·6H2O 水溶液加入棉酚與冰乙酸、丙酮混合液的方式有3 種:①先加入后加熱;②先加熱后加入;③先加入一半體積量，回流加熱時再加入另一半體積量。結果表明，3 種方法都能制備得到氧化產物，產率分別為91.06%，83.62%，89.21%，純度分別為95. 6%，88. 9%，93. 4%，即采用先加入FeCl3·6H2O 水溶液，后進行冷凝回流加熱的方法為好。

2.1.2 回流加熱溫度的選擇 對回流加熱的溫度進行考察。結果表明，80，90，100 ℃三個不同溫度制備得到的氧化產物的純度分別為82. 9%，94.6%，88. 4%，產 率 分 別 為83. 5%，90. 2%，92.3%。由于后續(xù)實驗需對氧化產物進行鑒定和拆分，要求其具有較高的純度，故選擇回流加熱溫度為90 ℃。

2.2 準確分子量的測定

經飛行時間質譜儀檢測，［M-H］－m/z 545.144 2的質譜圖見圖1。

圖1 棉酚氧化產物gossypolone 樣品QTOF MS 質譜圖Fig.1 Mass spectrum by QTOF MS of gossypolone

由圖1 可知，氧化產物M 的準確分子量為546.152 0;而 gossypolone 分 子 量 理 論 值 為546.151 8，說明反應產物與gossypolone 分子量吻合很好。

2.3 特征碎片離子

對氧化產物進行ESI 正、負離子的一級質譜全掃描，在正、負離子模式下均有特征離子峰，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力3 500 kPa，輔氣壓力1 750 kPa，毛細管溫度350 ℃，反吹壓力175 kPa，錐孔電壓2 100 kPa。經過優(yōu)化，得到3 個響應較高的氧化產物的碎片離子，m/z 分別為273. 1，244. 2，257.3，這3 個特征離子的產生均可由gossypolone 裂解產生，碎片離子質譜圖及裂解途徑見圖2。

圖2 碎片離子質譜圖及裂解途徑Fig.2 Fragment ion mass spectra and fragmentation pathways

2.4 gossypolone 純度

gossypolone HPLC 分析，結果見圖3。

圖3 gossypolone 樣品溶液HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of gossypolone sample solution

由圖3 可知，gossypolone 的保留時間為4.250 min，用面積歸一法計算得出gossypolone 的純度為95.7%。

3 結論

(1)以棉酚為原料，采用半合成法制備棉酚氧化產物gossypolone 的適宜條件為:先加入FeCl3·6H2O 水溶液后進行冷凝回流加熱，回流加熱溫度為90 ℃，產率90.2%。

(2)采用EIS-QTOF/MS 飛行時間質譜和LCMS/MS 對產物的結構進行驗證，確定制得的化合物為gossypolone，純度95.7%。

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