曹月坤，林曉東，李長波，姚秀清

亞硝酸鹽作為生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的一個自然組成部分，廣泛存在于天然水體中。水體中亞硝酸鹽是一種潛在危險物，含量過高會對人和動物產生毒害作用，是比較棘手的問題［1-2］。反硝化細菌是一類能利用亞硝酸鹽氮等為氮源，有機質為碳源，且能進行自身繁殖的微生物。在反硝化過程中，能將亞硝酸鹽轉化成氮氣從而達到降低水體中有害物質的積累。但直接應用反硝化細菌降解養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽會產生菌濃低、易流失、不容易控制等問題。固定化微生物技術強化生物脫氮過程是近年來研究的焦點。李芳芳等［3］研究了固定化硝化菌和好氧反硝化菌對氨氮廢水的處理，氨氮去除率達到90.31%，亞硝酸鹽積累僅0.032 mg/L。Lu Yu 等篩選了兩株細菌，分別為Stenotrophomonas sp. ZZ15 和Oceanimonas sp. YC13，添加到工業(yè)廢水處理裝置中可以增加硝酸鹽的去除率，固定化的ZZ15 和YC13與直接添加相比，去除率的增加幅度相對較低［4］。Christopher B Hill 等對比了硝化菌，以及硝化菌與反硝化菌的混合菌群固定化用于脫除廢水中氨氮的研究，結果發(fā)現兩種固定化細菌體系對氨氮的去除效果相當，不同之處在于固定化的硝化-反硝化菌體系沒有硝酸鹽積累［5］。鄭黎明對國內外包埋法固定化技術生物脫氮的研究進展進行了綜述，認為微生物固定化可以彌補傳統(tǒng)生物脫氮方法中的不足，達到高效脫氮的目的［6］。但大部分相關研究工作都針對生活或工業(yè)廢水，對較低亞硝酸鹽含量的養(yǎng)殖水體利用固定化反硝化菌處理的研究較少。本文以實驗室富集培養(yǎng)的反硝化細菌為研究對象，對其進行了包埋固定化，為固定化反硝化細菌降解亞硝酸鹽的應用提供基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉、聚乙烯醇、氯化鈉、氯化鈣、硝酸鈉、亞硝酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸、甲醇、氫氧化鈉、無水氯化鈣、硫酸銅、無水乙醇、硫酸鋅、硫酸肼、葡萄糖、鹽酸、檸檬酸、蔗糖均為分析純;磺胺、N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽均為化學純。

W-O 系列恒溫油水浴鍋;VIS-7220 可見分光光度計;LD5-2A 低速離心機;BT125D 電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 反硝化細菌的富集培養(yǎng) 富集培養(yǎng)基:葡萄糖5 g，硝酸鈉1 g，氯化鈣0. 67 g，磷酸氫二鉀6.7 g，10 L 水。

1.2.2 反硝化細菌菌懸液的制備 將本實驗富集培養(yǎng)的反硝化細菌培養(yǎng)液在4 000 r/min 條件下離心10 min，倒掉上清液，沉淀用自來水稀釋，制成菌懸液。

1.2.3 固定化反硝化細菌小球的制備 SA 制備的小球:①將SA 用水浸泡24 h，然后加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按照菌懸液與SA 溶液體積比1 ∶2 的比例混合，充分攪勻;③配制5%CaCl2溶液，用注射器將②配制的混合液緩慢滴入，不斷攪拌在液體中形成小球;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)4 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3次，備用。

PVA 制備的小球:①將浸泡24 h 的PVA 加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按菌懸液與PVA 溶液體積比1∶2 的比例混合，充分攪勻;③將配制的PVA-菌體混合液緩慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)10 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3 次，備用。

PVA+ SA 制備的小球:①將PVA 和SA 浸泡24 h，加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按菌懸液與PVA+SA 混合液(SA 和PVA 體積比1∶1)體積比1∶2 的比例混合，充分攪勻;③將配制的PVA+SA-菌體混合液緩慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)10 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3 次，備用。

1.2.4 不同包埋方法對亞硝酸氮去除的影響 配制NO2

－-N 濃度50 mg/L 和葡萄糖濃度140 mg/L的模擬養(yǎng)殖水體。按照1.2.3 節(jié)分別制備3 種小球各10 mL，然后分別加入到50 mL 的模擬養(yǎng)殖水體中，在28 ℃條件下處理，每24 h 測定-N 濃度。

1.3 分析方法

2 結果與討論

2.1 3 種不同固定化方法制備的反硝化細菌小球性質比較

分別以SA、PVA、PVA +SA 的混合物為包埋材料對反硝化細菌進行固定化，制備的3 種小球分別見圖1 ～圖3。

圖1 SA 固定的反硝化細菌小球Fig.1 The balls of denitriobacteria immobilized by SA

圖2 PVA 固定的反硝化細菌小球Fig.2 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA

圖3 SA+PVA 固定的反硝化細菌小球Fig.3 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA and SA

由圖1 ～圖3 可知，以SA 固定的反硝化細菌小球，制備時易成球，不易粘連較透明，交聯(lián)后的小球強度好，抗擠壓，彈性好。但在實驗過程中發(fā)現小球有明顯的消溶現象。48 h 后小球體積減少1/2，預計4 ～5 d 小球會完全破碎溶解。以PVA 固定的反硝化細菌小球，未滴前透明度最好，小球不易成型也不易變色，易粘連，不易分開，形成串珠狀，交聯(lián)后的小球強度低，擠壓后變形且不可恢復，粘度大，彈性差。以PVA+SA 混合物固定的反硝化細菌小球，小球大小均勻，形狀飽滿且不易粘連。交聯(lián)后，在強度、抗擠壓能力、彈性、大小方面與SA 小球相似。小球的顏色則介于SA 的半透明和PVA 的白色之間。試驗過程中，并沒有像SA 小球那樣明顯的消融現象，反應過程現象更接近于PVA 小球。

2.2 3 種不同固定化方法對反硝化細菌降解亞硝酸鹽的影響

將分別以SA、PVA 和PVA +SA(v/v =1∶1)包埋制備的反硝化細菌制成的小球置于模擬養(yǎng)殖水體中，分別測定培養(yǎng)24，48 h 的NO2－-N 去除率，并觀察小球變化情況，結果見圖4 。

圖4 3 種不同方法固定化小球對-N 脫除率的影響Fig.4 The effect of balls immobilized by different materials on removal rate of nitrite

由圖4 可知，3 種不同材料固定的反硝化細菌小球對NO2－-N 的去除率在24 h 均達到80%以上，去除率由高到低依次為:PVA、PVA + SA 和SA 小球，分別為85%，84%和82%。48 h 后3 種小球的去除率較24 h 都有所提高，但去除率最高的仍為PVA 小球，達到88%，其次PVA + SA 小球，達到87%。實驗過程中發(fā)現，SA 小球雖然有消融現象，但彈性和機械強度較好;而PVA 小球的彈性和機械強度較差，有比較嚴重的吸附粘連和膨脹現象，容易結成團狀，減小接觸面積，從而影響NO2－-N 的去除率;PVA+SA 混合小球的彈性、通透性和機械強度介于兩者之間，可減少小球的消融和粘連現象，增加小球的機械強度。

2.3 溫度對PVA +SA 反硝化細菌小球降解亞硝酸鹽氮效果的影響

以PVA+SA 混合包埋小球為研究對象，研究了不同溫度下不同時間反硝化細菌對NO2－-N 去除率的影響，結果見圖5。

圖5 溫度對PVA+SA 混合包埋小球-N 去除率的影響Fig.5 The effect of temperature on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由圖5 可知，24 h 時在20 ～32 ℃范圍內，隨著溫度的升高，亞硝酸鹽氮去除率呈增加的趨勢，32 ℃去除率達到82%，而20 ℃去除率僅為45%。隨著處理時間延長，20，25，28 ℃三個溫度的去除率都有所增加，但32 ℃時，48 h 和72 h 的去除率反而有所下降，反而低于相同時間28 ℃的去除率。原因可能為在24 h 時，適當提高溫度有利于反硝化細菌-N 的去除，但隨著時間的延長，高溫反而使反硝化細菌酶活性有所降低，因此采用28 ℃作為較合適的溫度。

2.4 PVA 和SA 不同比例對NO2－-N 去除效果的影響

選取PVA 與SA 比例為1∶1，5∶1 和10∶1 分別包埋制成小球，命名為小球a、小球b 和小球c?？疾炝薖VA 和SA 比例對NO2－-N 去除率的影響，結果見圖6。

圖6 不同比例包埋小球對-N 去除率的影響Fig.6 The effect of different proportion on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由圖6 可知，3 種小球在24 h 時的亞硝酸鹽氮去除率基本相同，隨著時間的延長，3 種小球的去除率都有所增加，但增加幅度不大，尤其是小球a。在48 h 和72 h 時，小球c 的去除率高于小球b，但相差不大。PVA 和SA 的不同比例影響了細胞的成活率、小球和溶液的接觸面積等，最終影響細胞的生物活性和反應速率。因為1∶1 和1∶5 比例的混合小球都存在輕微的消融現象，小球c 的比例1∶10 更適用于實際應用。

2.5 碳源對亞硝酸鹽氮去除效果的影響

以混合小球c 為考察對象，分別以檸檬酸、蔗糖、乙醇、葡萄糖、甲醇作為碳源，碳源濃度均為280 mg/L，結果見圖7。

圖7 碳源對小球-N 去除率的影響Fig.7 The effect of different carbon sources on removal rate of nitrite

由圖7 可知，小球c 利用這5 種不同碳源進行反硝化作用時，去除率有很大的不同。24 h 時，利用蔗糖和乙醇作為唯一碳源時，亞硝酸鹽氮去除效果最好，為35%和37%。當以葡萄糖和檸檬酸作為唯一碳源時，反硝化效果較蔗糖和乙醇低，去除率為29%和30%，最低的是甲醇為21%。隨著時間的延長，除了檸檬酸外，其它4 種碳源的去除率都有了較大程度的提高。以葡萄糖作為唯一碳源時，雖然在前期反硝化效果不及蔗糖，但后期去除效果有明顯增加，96 h 時，去除率由高到低依次為葡萄糖81%、乙醇71%、甲醇63%、蔗糖55.6%、檸檬酸38.6%。因此，可以考慮以葡萄糖作為較合適的碳源。

2.6 碳氮比對亞硝酸鹽氮去除效果的影響

對混合小球c 進行碳氮比考察，結果見圖8。

由圖8 可知，在4 種不同的碳氮比條件下，隨著時間的延長，NO2－-N 的去除率都隨之增大，并且除去碳氮比為25∶1 時，其它3 種比例都在48 h 時去除率達到較大值，之后增幅不大。同時，隨著碳氮比的減小，去除率相應增加?？赡艿脑蚴?，碳氮比越大，碳源相對越豐富，這使包埋的反硝化細菌有足夠的能源先滿足自身的生長代謝而延緩了反硝化作用的速率，同時足夠的碳源也使小球維持較穩(wěn)定的去除速率。但在實際應用中，碳源過多不但會使成本升高，也會延緩去除率的增加，延長達到理想去除效果的時間。鑒于圖8 的結果，選用2.5∶1 為較適宜的碳氮比。

圖8 不同C/N 比對包埋小球去除率的影響Fig.8 The effect of different C/N on removal rate of nitrite of balls

3 結論

本實驗所考察的3 種反硝化細菌固定化方法中，以海藻酸鈉和聚乙烯醇為混合材料制備的小球彌補了單一材料的不足，兼具兩種方法的優(yōu)勢。該種方法最適條件為:溫度28 ℃，聚乙烯醇和海藻酸鈉的比例為10∶1，葡萄糖為碳源，碳氮比2.5∶1，亞硝酸鹽氮的最大去除率72 h 能達到92%。

［1］ 吳美仙，李科，張萍華.反硝化細菌及其在水產養(yǎng)殖中的應用［J］.浙江師范大學學報:自然科學版，2008，31(4):467-471.

［2］ 姚秀清，劉秀梅. 反硝化細菌降解養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽的研究［J］.應用化工，2014，43(5):871-873.

［3］ 鄭黎明，蔣海濤，王羅春，等. 包埋固定化微生物處理含氮廢水的研究進展［J］. 環(huán)境科學與管理，2011，36(11):86-90.

［4］ 李芳芳，齊樹亭，石玉新.新型固定化硝化細菌和好氧反硝化細菌處理氨氮廢水［J］. 生態(tài)科學，2010，29(5):467-471.

［5］ Yu Lu，Liu Yanjun，Wang Gejiao. Identification of novel denitrifying bacteria Stenotrophomonas sp.ZZ15 and Oceanimonas sp.YC13 and application for removal of nitrate from industrial wastewater［J］. Biodegradation，2009，20:391-400.

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