曹玉杰， 薄凱亮， 程春燕， 錢春桃， 陳勁楓

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210095)

黃瓜(Cucumis sativus L.)起源于亞熱帶，屬于喜溫性植物，對低溫非常敏感。黃瓜作為中國早春、秋冬季節(jié)設(shè)施栽培的主要蔬菜作物，由于其冷敏性在生育期內(nèi)遇到0 ～15 ℃低溫時(shí)經(jīng)常遭受冷害，生理活動失調(diào)，生長緩慢或停止發(fā)育［1-5］，產(chǎn)量和品質(zhì)顯著下降。因而提高黃瓜的耐冷性依然是目前設(shè)施栽培黃瓜的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。當(dāng)前，關(guān)于改善黃瓜抗冷性的措施主要包括以下幾個方面:培育耐低溫品種、改進(jìn)栽培措施、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和采用化學(xué)調(diào)控技術(shù)，這些方法的應(yīng)用有賴于黃瓜耐冷機(jī)制的最終闡明，而應(yīng)用不同方法提高黃瓜抗冷能力的研究也將有利于黃瓜耐冷機(jī)制的進(jìn)一步闡明。目前已有多種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)被報(bào)道可以提高黃瓜幼苗的抗冷性，如:5-氨基乙酰丙酸［6］、腐胺、亞精胺和精胺［7-9］、脫落酸、水楊酸［10］、殼聚糖、表油菜素內(nèi)酯、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸甲酯等。我們的前期研究結(jié)果表明黃瓜發(fā)芽期耐冷性與賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)有關(guān)，而尸胺(Cad)是賴氨酸脫羧酶的產(chǎn)物，推測Cad與黃瓜發(fā)芽期耐冷性有關(guān)［11］。已有報(bào)道就尸胺對水稻種子萌發(fā)的作用進(jìn)行了研究［12］。而黃瓜種子低溫發(fā)芽能力與苗期的耐冷性呈顯著正相關(guān)，所以關(guān)于尸胺與黃瓜耐冷性的關(guān)系是一條值得探索的新途徑，對于深入探討黃瓜耐冷性機(jī)制研究具有重要意義。本試驗(yàn)研究Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性、膜脂過氧化作用及可溶性物質(zhì)含量等的影響，以期為改善黃瓜耐冷性、進(jìn)一步研究黃瓜的耐冷機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜材料［11］由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃瓜課題組提供，一份材料為耐冷性材料長春密刺，另一份材料為冷敏性材料北京截頭。

1.2 幼苗培養(yǎng)

分別將兩份材料種子消毒，55 ℃溫湯浸種，放于鋪有2 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃黑暗條件下催芽。種子發(fā)芽后播于裝有草炭∶ 蛭石=1∶ 1 的塑料營養(yǎng)缽中，于日光溫室內(nèi)培養(yǎng)。每2 d 澆灌1次1/2 倍Hoagland 營養(yǎng)液，中間澆清水，幼苗培養(yǎng)至2 片真葉完全展平時(shí)用作試驗(yàn)材料進(jìn)行處理。

1.3 試驗(yàn)處理

幼苗在低溫處理開始前12 h，進(jìn)行如下處理:(1)噴施清水(對照);(2)噴施1 mmol/L Cad (分析純，購于Sigma 公司)。每200 ml 噴施的溶液(包括對照)中加入1 滴(約0.05 ml)吐溫-20，以提高附著葉片的能力。用微型塑料噴霧器對植株2 片真葉噴施清水或Cad 溶液，以溶液不從葉面下滴為宜(注意不要滴到培養(yǎng)基質(zhì)中)。將幼苗轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，選用晝/夜溫度為12 ℃/7 ℃的溫度作為冷處理溫度，光照度為 150 μmol /(m2·s)，光周期為12 L/12 D，相對濕度為60% ～75%，處理2 d。第3 d 將幼苗移回常溫狀態(tài)，恢復(fù)2 d，這期間間隔給幼苗澆Hoagland 營養(yǎng)液(1/2 倍)。在冷害處理的0 d、1 d、2 d 及恢復(fù)后2 d分別取樣測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，重復(fù)3 次。

1.4 測定指標(biāo)與測定方法

電解質(zhì)滲漏率測定采用沈文云等的方法［13］;MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法［14］;SOD 活性測定參考李合生的方法［15］;POD 活性測定按照Quintanilla-Guerrero 等［16］的方法;CAT活性測定參照Aebi［17］的方法;APX 活性參照Nakano 等［18］的方法測定;可溶性總糖的含量采用蒽酮比色法測定［19］;可溶性蛋白質(zhì)含量測定按照文獻(xiàn)［20］的考馬斯亮藍(lán)G-250 方法;游離脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法［21］;葉綠素含量測定參照沈偉其［22］的乙醇提取方法。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定［23］，分別于處理后第0 d、2 d、恢復(fù)后2 d 選取幼苗第2 片真葉采用mini-PAM(Walz，德國)便攜式調(diào)制熒光儀測定。測定前將葉片夾入葉夾暗適應(yīng)20 min，然后依次測得參數(shù)最小熒光(F0)、最大熒光(Fm)，并計(jì)算可變熒光Fv、PSII 原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)、PSII 的潛在光化學(xué)活性(Fv/F0)以及Fm/F0。每個處理重復(fù)3 次。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗相對電導(dǎo)率的影響

低溫脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，細(xì)胞質(zhì)相對電導(dǎo)率增加。由圖1 可以看出，低溫脅迫2 d 后，長春密刺和北京截頭黃瓜幼苗葉片電解質(zhì)滲透率均顯著增加，分別為處理前的158.33%、181.26%，而且冷敏材料北京截頭較耐冷材料長春密刺高出15.77%，說明低溫脅迫對北京截頭細(xì)胞膜造成的損傷較重;外源Cad 預(yù)處理可使兩份材料幼苗電解質(zhì)滲透率分別比對照降低18.61%、9.54%，說明Cad 對長春密刺的緩解效果大于對北京截頭的緩解效果。提示外源尸胺預(yù)處理有利于維持細(xì)胞膜半透性的穩(wěn)定，有效緩解電解質(zhì)外滲。在恢復(fù)期，除北京截頭對照的電解質(zhì)滲透率仍保持較高水平外，其他處理均基本恢復(fù)到處理前的水平。

圖1 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗電解質(zhì)滲透率的影響Fig.1 Effect of exogenous Cad on electrolytic leakage rate in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

2.2 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗MDA 含量的影響

丙二醛(MDA)是膜過氧化作用的終產(chǎn)物，其積累程度可以反映植物膜系統(tǒng)的損傷程度。如圖2 所示，低溫處理后兩份材料MDA 含量皆有顯著增加，在處理后1 d、2 d 長春密刺MDA 含量分別為處理前的117.97%、110.03%，北京截頭MDA含量分別為處理前的127.97%、131.91%，說明低溫脅迫引發(fā)北京截頭膜脂過氧化的程度大于長春密刺;外源Cad 處理使長春密刺MDA 含量在低溫脅 迫 后1 d、2 d 較 對 照 分 別 降 低13.13%、10.10%，北京截頭MDA 含量在低溫脅迫后1 d、2 d 較對照分別降低12.54%、11.49%。在恢復(fù)期，除北京截頭對照的MDA 含量仍保持較高水平外，其他處理MDA 含量則降低到與處理前相同或比處理前更低的水平。

圖2 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片MDA 含量的影響Fig.2 Effects of exogenous Cad on MDA contents in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

2.3 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3 可知，兩份材料長春密刺、北京截頭在低溫脅迫下可溶性蛋白質(zhì)含量均增加，在低溫處理后1 d，分別比處理前增加10.30%、9.14%，處理后2 d分別比處理前增長了18.66%、13.81%;Cad 預(yù)處理可使低溫處理下長春密刺、北京截頭可溶性蛋白質(zhì)含量在處理后1 d 時(shí)比對照分別提高9.82%、3.11%，在2 d 時(shí)相對于對照分別上升16.99%、11.20%，外源Cad 對長春密刺的促進(jìn)蛋白質(zhì)含量增加的效果大于北京截頭。說明噴施外源Cad 能促進(jìn)低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的增加，提高葉片細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)幼苗對低溫脅迫的抗性。在恢復(fù)期，各處理基本恢復(fù)到處理前的水平或略低于處理前的水平。

2.4 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

圖3 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of Cad on soluble protein content in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

可溶性糖類作為植物體內(nèi)一類重要的滲透調(diào)節(jié)劑，其在逆境脅迫下的積累對增加細(xì)胞汁液濃度，降低細(xì)胞水勢，提高植物的抗逆性有重要作用［24］。圖4 表明低溫脅迫處理使長春密刺及北京截頭幼苗可溶性糖含量上升，處理后1 d 即增加顯著，分別比處理前高出8.73%、7.95%，2 d 時(shí)分別是處理前的1.18 倍和1.15 倍，提示植株通過調(diào)節(jié)體內(nèi)可溶性糖的含量來對抗外界低溫脅迫。外源Cad 預(yù)處理可以提高長春密刺、北京截頭可溶性糖的含量，處理后2 d 分別比對照提高9.35%、2.90%。在恢復(fù)期，各處理基本恢復(fù)到處理前或略低于處理前的水平。

圖4 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of exogenous Cad on soluble sugar content in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

2.5 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸作為植物體內(nèi)的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量變化對低溫比較敏感［25］。由圖5 所示，低溫脅迫處理使長春密刺、北京截頭幼苗脯氨酸含量上升明顯，處理后1 d 分別比處理前上升了19.08%、10.59%，處理后2 d 分別比處理前增加52.04%、42.37%;Cad 預(yù)處理可以提高低溫脅迫下兩種材料的脯氨酸含量，與單純低溫脅迫相比，在1 d、2 d 時(shí)長春密刺分別提高14.57%、20.54%，北京截頭分別提高14.37%、17.36% 。在恢復(fù)期，各處理脯氨酸水平略高于處理前。

圖5 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗脯氨酸含量的影響Fig.5 Effect of exogenous Cad on proline content in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

2.6 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

本試驗(yàn)對兩份材料中的抗氧化酶SOD、POD、CAT 和APX 的活性進(jìn)行了測定，以期了解低溫條件下這些酶的調(diào)節(jié)功能。如圖6 所示，在低溫處理后1 d，長春密刺SOD 活性比處理前增加5.65%，北京截頭卻比處理前下降11.26%;在脅迫后2 d 長春密刺、北京截頭SOD 活性分別比處理前提高24.76%和7.29%。Cad 處理可明顯提高低溫脅迫下長春密刺、北京截頭幼苗葉片SOD 活性，低溫處理后1 d 分別比對照增加10.28%、9.64%，2 d 時(shí)分別比對照增加21.72%、8.42%。在恢復(fù)期，除北京截頭對照尚未恢復(fù)到處理前的活性水平外，其他處理均恢復(fù)到處理前的活性水平。

長春密刺和北京截頭的POD 活性低溫處理后1 d 分別比處理前下降了7.75%和12.56%，而在脅迫后2 d，長春密刺POD 活性為處理前的102.64%，北京截頭僅為處理前的79.84%。噴施Cad 可使低溫條件下長春密刺和北京截頭幼苗葉片POD 活性在1 d 時(shí)分別比處理前提高10.37%和3.87%，2 d時(shí)分別比處理前提高23.37%和10.68%;長春密刺和北京截頭幼苗葉片POD 活性在1 d 時(shí)分別比對照提高19.83%和18.97%。在恢復(fù)后2 d，各處理的酶活性基本恢復(fù)到處理前的水平。

低溫處理使長春密刺和北京截頭葉片CAT 活性均明顯降低，于1 d 時(shí)分別比處理前降低14.49%和25.78%，2 d 時(shí)分別比處理前降低10.13% 和34.62%。Cad 預(yù)處理可促進(jìn)長春密刺、北京截頭葉片CAT 活性的增加，在1 d 時(shí)分別比處理前升高6.81%、4.20%;在2 d 時(shí)分別比處理前升高18.39% 和降低7.73%，而比對照分別提高31.95%、41.29%。各處理葉片CAT 活性恢復(fù)2 d 后趨于處理前的酶活性水平。

低溫處理后1 d 和2 d 長春密刺葉片APX 活性上升，分別為處理前的1.18 倍和1.43 倍，北京截頭分別為處理前的91.49%和117.39%。外源Cad 可使低溫處理下長春密刺、北京截頭葉片APX 活性提高，1 d 時(shí)長春密刺和北京截頭幼苗葉片APX 活性分別是處理前的1.27 倍和1.12 倍，2 d 時(shí)分別為處理前的1.60 倍和1.32 倍;2 d 時(shí)長春密刺和北京截頭幼苗葉片APX 活性比對照分別提高10.66%和17.13%。在恢復(fù)期各處理APX 活性恢復(fù)到低溫處理前的水平。

綜上所述，外源尸胺引起黃瓜長春密刺及北京截頭低溫處理過程中SOD、POD、CAT、APX 活性的提高，且長春密刺中這4 種抗氧化酶的活性在各個檢測點(diǎn)均高于或略高于北京截頭。

圖6 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of Cad on antioxidant enzymes activities in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

2.7 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

初始熒光F0是PSII 反應(yīng)中心處于完全開放狀態(tài)時(shí)的熒光產(chǎn)量［23］。如圖7 所示，低溫脅迫處理后，長春密刺與北京截頭F0均顯著增加，說明低溫脅迫引發(fā)幼苗葉片PSII 反應(yīng)中心失活，發(fā)生了可逆或不可逆?zhèn)?北京截頭增幅大于長春密刺，說明其PSII 反應(yīng)中心受到的損傷較大。Cad 預(yù)處理可以明顯降低低溫脅迫過程中F0的增加，說明其對低溫下黃瓜幼苗葉片光合機(jī)構(gòu)PSII 的損壞具有明顯的緩解作用。

最大熒光Fm是PSII 反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度［23］。由圖7 可知，低溫條件下長春密刺與北京截頭的Fm均明顯下降，而長春密刺Fm下降幅度小于北京截頭，Cad 預(yù)處理可明顯緩解低溫條件下兩者幼苗葉片F(xiàn)m的下降。

可變熒光Fv是Fm與F0的差值，反映光合作用中PSⅡ原初電子受體QA 的還原情況［23］。圖7 表明低溫條件下長春密刺與北京截頭的Fv顯著下降，Cad 預(yù)處理可使低溫條件下兩份材料Fv下降減少?；謴?fù)2 d 后各處理F0、Fm、Fv基本恢復(fù)到處理前的水平。

Fv/Fm表示PSII 的最大光化學(xué)效率［23］。從圖7可以看出，長春密刺與北京截頭的Fv/Fm在低溫脅迫后顯著下降，說明低溫脅迫降低了黃瓜葉片PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率;而長春密刺下降幅度小于北京截頭，說明長春密刺PSⅡ反應(yīng)中心所受的傷害較輕，反應(yīng)中心進(jìn)行光合作用的能力較高;Cad 預(yù)處理有效減緩了兩份材料Fv/Fm的降低，但仍低于處理前的水平。而在恢復(fù)期，各處理的Fv/Fm均恢復(fù)到略低于處理前的水平。

Fv/F0代表了PSII 的潛在活性［23］。如圖7 所示，低溫脅迫處理2 d 使北京截頭Fv/F0顯著下降，并且大于長春密刺，表明北京截頭PSII 活性中心受損比長春密刺嚴(yán)重;Cad 預(yù)處理可使兩份材料Fv/F0有一定程度的恢復(fù)，但仍低于處理前的水平?；謴?fù)后2 d 各處理Fv/F0仍略低于處理前的水平，表明PSII 活性中心水平仍未恢復(fù)到處理前的狀態(tài)。

Fm/F0用來表示通過PSⅡ的電子傳遞情況［23］。圖7 表明低溫條件下Fm/F0顯著降低，說明通過PSⅡ的電子傳遞受到抑制;Cad 預(yù)處理可明顯緩解低溫下Fm/F0的下降，一定程度上促進(jìn)了電子的順利傳遞。在恢復(fù)期除北京截頭對照略低于處理前外，其他處理基本恢復(fù)到處理前的狀態(tài)。

圖7 外源Cad 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.7 Effects of exogenous Cad on chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of cucumber seedlings under low temperature stress

3 討論

黃瓜發(fā)生冷害的生理機(jī)制之一是低溫脅迫對細(xì)胞膜造成的損傷。而低溫引起的活性氧(ROS)積累是造成細(xì)胞膜損傷的化學(xué)原因［26］，由此產(chǎn)生的MDA 一定程度上反映了活性氧在植物體內(nèi)過量積累對細(xì)胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生傷害的程度［27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明低溫脅迫處理使長春密刺和北京截頭的MDA含量顯著增加，后者大于前者，說明低溫脅迫造成黃瓜幼苗細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷，北京截頭細(xì)胞膜受傷害程度大于長春密刺?？寡趸富钚运酱碇鴮钚匝醯那宄剑?7］。在抗氧化酶類SOD、POD、CAT、APX 中，APX 起維護(hù)活性氧信號調(diào)節(jié)作用，而SOD 和CAT、POD 共同作用可以使超氧陰離子自由基和H2O2轉(zhuǎn)變成水和氧，維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡［28］。本試驗(yàn)結(jié)果表明低溫脅迫引起黃瓜長春密刺的抗氧化酶(SOD、POD、APX)活性增加，而引起黃瓜北京截頭的抗氧化酶活性降低;據(jù)此認(rèn)為長春密刺較北京截頭有著相對較強(qiáng)的活性氧清除水平，進(jìn)而表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的耐低溫能力。綜合前人研究，低溫脅迫下SOD、POD、CAT 等酶活性變化趨勢存在差異，這可能與研究者所用材料種類［29-31］、低溫處理強(qiáng)度［29-32］、低溫處理方式(漸降、直接及自然低溫)、處理的時(shí)期、以及取樣部位等的不同有關(guān)。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，尸胺(Cad)處理使黃瓜幼苗葉片中MDA 含量低于對照，而使幼苗葉片抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性高于對照，據(jù)此認(rèn)為Cad 可以提高低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性，增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧的能力，降低質(zhì)膜過氧化程度，減少M(fèi)DA 積累，有利于維持細(xì)胞膜的完整性，降低細(xì)胞質(zhì)膜透性。Shen 等［32］的研究結(jié)果表明其他多胺在增強(qiáng)黃瓜耐冷性時(shí)表現(xiàn)出相似的耐冷生理作用機(jī)制。

低溫脅迫下植物體內(nèi)可溶性糖的含量增加，可溶性糖含量與植物的抗冷性密切相關(guān)［33］;脯氨酸是非常重要和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸含量的高低可作為衡量植物抗冷性的指標(biāo)［34］;可溶性蛋白質(zhì)因?yàn)槠錁O強(qiáng)的親水特性，可提高細(xì)胞的持水力，因此可提高植物的抗冷性，可溶性蛋白質(zhì)含量與抗冷性表現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系［35］。電解質(zhì)滲漏率的增加是膜相變和膜脂過氧化雙重反應(yīng)的結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明低溫脅迫使長春密刺和北京截頭葉片內(nèi)可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)含量以及電解質(zhì)滲透率均增加，而外源尸胺處理可使這些細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)的含量進(jìn)一步提高，而使電解質(zhì)滲透率的增加量減少。據(jù)此認(rèn)為外源尸胺還可以通過誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉內(nèi)的非抗氧化系統(tǒng)(通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)成分)維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞質(zhì)膜透性，進(jìn)而增強(qiáng)幼苗對低溫脅迫的適應(yīng)性。有研究報(bào)道脯氨酸的積累需要碳水化合物，碳水化合物通過氧化磷酸化作用為脯氨酸的合成提供必要的氫和還原能力［36］，可溶性糖和脯氨酸的同步積累可能與此相關(guān)。

植物在低溫條件下，葉綠體會受到破壞，葉綠素含量下降，從而發(fā)生嚴(yán)重的光抑制現(xiàn)象。正常情況下葉綠素?zé)晒馀c光化學(xué)反應(yīng)、發(fā)射和熱耗散是相互聯(lián)系的［37］，可以通過對熒光的監(jiān)測來研究光合作用效率和熱耗散的相關(guān)情況。本試驗(yàn)測定結(jié)果表明低溫脅迫使黃瓜幼苗F0上升，表明PSⅡ反應(yīng)中心失活，結(jié)合Fv/F0和Fv/Fm的降低，則反映出PSⅡ的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)換效率的減弱。而Cad 預(yù)處理可以緩解低溫脅迫引起的黃瓜幼苗的光抑制，一定程度上恢復(fù)PSⅡ的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)換效率，提高光合作用效率。

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