肇 瑩， 楊 鎮(zhèn)， 楊 濤， 曹 君， 馬曉穎， 肖 軍

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/微生物工程中心，遼寧 沈陽110161)

草坪是人類生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，綠色的草坪不僅能美化環(huán)境、凈化空氣、防止水土流失，還能降低噪音、調(diào)節(jié)大氣溫度與濕度［1-2］。草坪草作為一種優(yōu)良的綠化物種，在城市綠地建設(shè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，中國地域遼闊，氣候各樣，干旱和半干旱地區(qū)的總面積占國土總面積的47%［3］。水資源的匱乏已是一個普遍性的問題，人們在日益倚重于草坪的功能性、娛樂性和觀賞性的同時，又面臨著解決草坪草生長所需水分的問題。因此，抗旱性研究是草坪科學(xué)領(lǐng)域不可忽視的方向。

內(nèi)生真菌是一類在植物體內(nèi)度過大部分或全部生命周期、而宿主植物不顯示外部癥狀的一類真菌［4］。由于內(nèi)生真菌與植物共生關(guān)系對植物的影響顯著，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。特別是內(nèi)生真菌代謝物能促進(jìn)植物生長發(fā)育及提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力逐漸受到研究者的重視。

筆者從不同植物中分離并篩選了大量內(nèi)生真菌，獲得了具有誘導(dǎo)草坪草提高抗旱能力的3 株內(nèi)生真菌醇提取物，并對這3 株菌進(jìn)行了種屬鑒定，分別為鏈格孢屬(Alternariasp)、鏈格孢種(Alternaria alternata)、晶粒鬼傘種(Coprinus micaceus)。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對草坪草進(jìn)行了4 種濃度PEG-6000 模擬干旱脅迫處理，通過噴施3 株菌醇提取物的混合物，測定草坪草形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)，深入研究植物內(nèi)生菌醇提取物誘導(dǎo)草坪草提高抗旱性的效果，為其在草坪草上的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和材料

本試驗(yàn)在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院盆栽場完成。

供試草坪:為冷季型草坪草，多年生草地早熟禾(品種為優(yōu)異)。

供試材料:來源于3 株野生植物根系內(nèi)生菌醇提取物，分別標(biāo)記為R、S、D，其生產(chǎn)菌株分別為鏈格孢屬(Alternariasp)、鏈格孢種(Alternaria alternata)、晶粒鬼傘種(Coprinus micaceus)，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心分離保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用培養(yǎng)盆(直徑28 cm、高30 cm)種植草坪草，基質(zhì)配比為沙∶ 草炭∶ 有機(jī)肥=4∶ 1∶ 2(體積比)，且每盆裝入同等質(zhì)量的基質(zhì)。待草坪草成坪后，葉面均勻噴施植物內(nèi)生菌醇提取物混合物R+S+D(50.0 ng/ml +0.5 ng/ml +50.0 ng/ml)，噴施清水作為對照。2 d 后，用不同濃度的聚乙二醇(PEG-6000)溶液(0、10%、20%、30%)對草坪草模擬干旱(無、輕度、中度、重度)脅迫處理，分別于處理后第8 d 進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定，每個處理3 次重復(fù)。

1.3 草坪管理

草坪修剪:試驗(yàn)草坪修剪高度為5 cm，試驗(yàn)期間每14 d 修剪1 次，以后修剪高度相同。水分管理:草坪草按需水情況進(jìn)行定量澆水，模擬干旱脅迫處理。病蟲害控制:根據(jù)天氣狀況及草坪草生長情況使用殺菌劑進(jìn)行病害預(yù)防，保證草坪草正常生長。

1.4 測定內(nèi)容與方法

1.4.1 形態(tài)指標(biāo)測定 自干旱脅迫處理開始第8 d，采用五點(diǎn)取樣法測定每盆植株生物量。(1)株高測定:株高凈增高度=植株株高－草坪修剪高度。(2)草屑量測定:每盆中間直徑20 cm 部分所收集的草屑在105 ℃殺青1 h，再在80 ℃烘至恒質(zhì)量，后稱質(zhì)量。(3)根系干物質(zhì)量測定:取出植株根系，將根部細(xì)砂輕輕洗去，在水中將根系理順，放入盛滿水的根盤中，吸水紙沾干，取地下部分進(jìn)行根系分析。

1.4.2 生理生化指標(biāo)測定 (1)采用TTC 法測定根系活力［5］，單位為mg/(g·h)，F(xiàn)W。(2)參照萃取比色法測定葉綠素含量［6］，單位為(mg/g)，F(xiàn)W。(3)采用蒽酮法測定可溶性糖含量［7］，單位為%。(4)采用茚三酮比色法測定脯氨酸(Pro)含量［8］，單位為(μg/g)，F(xiàn)W。(5)采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量［9］，單位為(μmol/g)，F(xiàn)W。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel、SPSS11 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、整理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草株高、草屑量、根干質(zhì)量的影響

草坪草根系的好壞是影響草坪素質(zhì)的重要因素，而干物質(zhì)積累是反映草坪草生長情況的另一項(xiàng)重要指標(biāo)［10］。從表1 可知，在不同濃度PEG-6000脅迫下，噴施R+S+D 草坪草株高、草屑量、根干質(zhì)量均高于噴施清水(對照)處理;與噴施清水(對照)相比，在無干旱脅迫時，噴施R+S +D 草坪草株高、草屑量、根干質(zhì)量分別增加3.4%、3.3%、3.8%;輕度脅迫(10% PEG-6000)時，噴施R +S +D 草坪草株高、草屑量、根干質(zhì)量分別提高6.5%、3.1%、11.6%;中度脅迫(20% PEG-6000)時，噴施R+S+D 草坪草株高、草屑量、根干質(zhì)量分別提高25.1%、77.4%、24.6%;重度脅迫(30% PEG-6000)時，對照草坪草幾乎沒有生長，R +S +D 處理的草坪草生長緩慢。表明在干旱脅迫下，植物內(nèi)生菌醇提取物明顯提高了草坪草的抗旱能力，且其完全能夠抵抗低、中度干旱脅迫。

表1 干旱脅迫對各處理草坪草生物量的影響Table 1 Effect of drought stress on biomass of turfgrass in each treatment

2.2 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草生理生化特性的影響

2.2.1 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪根系活力的影響 由圖1 可知，隨著干旱脅迫濃度的升高，噴施R+S+D 和清水(對照)的草坪草根系活力均出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且噴施R+S +D 的草坪草根系活力始終高于對照。輕度脅迫下(10% PEG-6000)，噴施R+S+D 和對照的根系活力最高，但兩者差異并不顯著;中度脅迫下(20% PEG-6000)，R+S+D 處理的根系活力顯著高于對照，是其1.75倍;高度脅迫下(30% PEG-6000)，R +S +D 和清水處理的根系活力均明顯下降，說明高濃度的干旱脅迫超過了草坪草根系的適應(yīng)能力范圍，趨于死亡。表明，當(dāng)PEG-6000濃度達(dá)20%中度脅迫時，R +S +D 處理明顯提高了草坪草的根系活力，對草坪草抗旱能力起顯著作用。

2.2.2 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草葉綠素含量的影響 葉綠素與光合密切相關(guān)，其含量在一定程度上反應(yīng)了植物光合能力的強(qiáng)弱［11］。在不同濃度PEG-6000 脅迫下，噴施R+S +D 和清水(對照)的葉綠素含量變化見圖2。隨著脅迫濃度的升高，噴施R+S+D 和對照的葉綠素含量呈現(xiàn)出總體下降趨勢，R+S+D 處理的葉綠素含量由最初的3.18 mg/g降為最后的1.31 mg/g。對照葉綠素含量由最初的3.16 mg/g降為最后的0.72 mg/g。當(dāng)脅迫濃度為0、10.0%時，2個處理的葉綠素含量變化不明顯，當(dāng)PEG-6000 濃度增高到20%、30%時，R+S+D 處理的葉綠素含量較對照分別高出46.0%、59.0%，且存在顯著差異?？梢?，在中度和重度干旱脅迫下，噴施R+S+D 能提高草坪草葉綠素含量，增強(qiáng)葉片的光合能力和綠度，對草坪草抗旱起顯著作用。

圖1 干旱脅迫對草坪草根系活力的影響Fig.1 Effects of drought stress on the root activities of turfgrass

2.2.3 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草可溶性糖含量的影響 可溶性糖是高等植物的主要代謝產(chǎn)物之一，糖作為代謝的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物調(diào)節(jié)了植物生長、發(fā)育、抗性形成等多個生理過程，同時參與了胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［12］。由圖3 可知，在無干旱脅迫時，噴施R+S+D 和清水(對照)的草坪草可溶性糖含量無明顯差異，可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的增大而增加。當(dāng)脅迫濃度為0、10%時，噴施R+S+D 和對照的可溶性糖含量間差異不明顯;當(dāng)脅迫達(dá)到20%、30% PEG-6000 時，R+S+D 處理的可溶性糖含量顯著高于對照，分別高出20.1% 和28.0%。尤其PEG-6000 濃度達(dá)到30%時，表現(xiàn)最為明顯。表明在20%和30% PEG-6000 的模擬干旱脅迫環(huán)境中，噴施R+S+D 能促進(jìn)草坪草體內(nèi)糖分的積累，從而提高草坪草的抗旱性。

圖2 干旱脅迫對草坪草葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on chlorophyll contents of turfgrass

圖3 干旱脅迫對草坪草可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of drought stress on soluble sugar of turfgrass contents

2.2.4 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草脯氨酸含量的影響 游離脯氨酸是草坪草蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離狀態(tài)廣泛存在于草坪草體中。結(jié)果(圖4)顯示，在正常水分條件下，與噴施清水(對照)相比，噴施R +S +D 草坪草體內(nèi)脯氨酸積累量上升幅度不大，無明顯差異。在干旱脅迫環(huán)境中，草坪草的脯氨酸積累量對干旱脅迫的反應(yīng)十分敏感，迅速升高，且上升幅度有很大差異。與噴施清水(對照)相比，噴施R +S +D 的草坪草體內(nèi)脯氨酸含量積累量顯著增加。隨著干早脅迫的加重，當(dāng)PEG-6000 濃度達(dá)到10%、20%、30%時，噴施R+S+D 的草坪草脯氨酸積累量分別是對照的1.1 倍、1.4 倍、1.2 倍，尤其當(dāng)PEG-6000 濃度達(dá)20%時，差異最為顯著。當(dāng)PEG-6000濃度升高到30%時，脯氨酸含量呈現(xiàn)下降趨勢。

草坪草脯氨酸積累量越大越有利于抗旱，由此推斷噴施R+S+D 的草坪草有利于維持葉片水勢，當(dāng)PEG-6000 濃度達(dá)20%時，草坪草對干旱脅迫的適應(yīng)性最強(qiáng)，抗旱性相對較好。

圖4 干旱脅迫對草坪草脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of drought stress on proline contents of turfgrass

2.2.5 植物內(nèi)生菌醇提取物對草坪草丙二醛含量的影響 丙二醛可引起生物大分子的變性或降解及生物合成的降低，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［13］。本試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，隨著干早脅迫的加重，噴施R+S+D 和清水(對照)的丙二醛含量都有不同程度的升高。正常水分環(huán)境下，噴施R +S +D 和清水的丙二醛含量比較穩(wěn)定，基本維持在同等水平。不同濃度的PEG-6000脅迫下，對照丙二醛含量增加幅度高于噴施R +S +D。當(dāng)PEG-6000 濃度達(dá)到20.0%時，噴施R +S +D和對照的丙二醛含量波動較大，開始迅速上升，對照的丙二醛含量增加幅度顯著高于噴施R+S+D，是其1.15 倍。當(dāng)PEG-6000 濃度達(dá)到30.0%時，2 個處理的丙二醛含量繼續(xù)上升，但兩者間差異不顯著。表明R+S+D 在20% PEG-6000干旱脅迫下明顯降低了脂質(zhì)過氧化的速度，減少丙二醛對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。

圖5 干旱脅迫對草坪草丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of drought stress on malondialdehyde contents of turfgrass

3 討論

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部分的生長和營養(yǎng)狀況［14］。植物組織的根系活力狀況在一定程度上能夠反應(yīng)植物的抗旱性強(qiáng)弱。本研究中，中輕度脅迫時根系活力增加、呼吸速率加快，可以認(rèn)為是植物對逆境的適應(yīng)性反應(yīng)。隨著脅迫強(qiáng)度的增加，根系活力逐漸下降。在中度干旱脅迫下，噴施植物內(nèi)生菌醇提取物(R +S +D)的草坪草根系活力雖然有所降低，但明顯高于噴施清水(對照)，說明草坪草在中度干旱脅迫下，R +S +D 能夠減緩逆境對根系的影響。

中度干旱脅迫時，Hays 等［15］對幾個暖季型草的研究認(rèn)為根系活力是枝條生長的主要因素。本研究在中度干旱脅迫時，噴施R+S+D 的根系干質(zhì)量比對照增加了24.6%，表明中度脅迫下R+S+D 顯著地延緩了根系的衰老，促進(jìn)了草坪草生物量的提高。同時，根系活力的相對增強(qiáng)也促進(jìn)了草坪草的光合作用。

可溶性糖和脯氨酸做為植物調(diào)節(jié)物質(zhì)在干旱脅迫下大量積累，導(dǎo)致細(xì)胞液濃度增加，這對細(xì)胞膨壓的維持，細(xì)胞內(nèi)束縛水含量的提高，細(xì)胞液流動性的增強(qiáng)等均有所幫助。本研究中，在干旱脅迫條件下，可溶性糖含量隨著干旱脅迫的加重而有不同程度的上升，噴施R+S+D 的草坪草可溶性糖含量高于對照。脯氨酸含量在重度脅迫時有所下降，但噴施R+S+D 草坪草的下降幅度小于對照。

植物在經(jīng)受環(huán)境脅迫(如低溫、干旱等)過程中產(chǎn)生的損傷在很大程度上與產(chǎn)生過量的活性氧有關(guān)。干旱脅迫干擾了植物細(xì)胞中的自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡，自由基在細(xì)胞中積累使蛋白質(zhì)氧化和生物膜膜脂受到傷害，導(dǎo)致植物受損［16］。本研究中，從草坪草生物量增加不難看出，R +S +D 確實(shí)提高了草坪草的抗旱能力。通過對草坪草丙二醛含量的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下噴施R+S +D 與對照的丙二醛含量隨著脅迫程度的增強(qiáng)始終呈上升趨勢。但噴施R+S +D 的丙二醛生成量明顯低于對照。因?yàn)楸┦悄ぶ^氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量的高低代表膜脂過氧化的程度，即丙二醛含量越高，膜脂過氧化程度越嚴(yán)重，膜透性越大［17］。由此說明在干旱脅迫下草坪草發(fā)生了明顯的膜脂過氧化作用，且隨著干旱脅迫程度的增加造成的膜脂過氧化程度逐漸嚴(yán)重。噴施R +S +D 的丙二醛生成量顯著低于對照，說明干旱脅迫下，噴施R +S +D的草坪草膜脂過氧化程度低于對照。

植物內(nèi)生菌提取物的使用是一個非常復(fù)雜的問題，外用植物內(nèi)生菌提取物必然會引發(fā)其生理生化特性甚至形態(tài)上的效應(yīng)［18］。因此，確切地了解和掌握干旱脅迫條件下施用植物內(nèi)生菌提取物對草坪草形態(tài)和生理的影響，對干旱環(huán)境條件下廣泛應(yīng)用植物內(nèi)生菌提取物具有重要意義［19］。

目前，對草坪草的抗旱性研究已逐漸得到重視，通過植物內(nèi)生菌和內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物減輕干旱脅迫的影響還有待進(jìn)一步深入研究，同時應(yīng)注重調(diào)查、篩選和利用增強(qiáng)草坪草抗旱性的內(nèi)生菌資源，借鑒一些可提高作物抗旱性的技術(shù)措施。

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