李永輝，譚銀豐，袁貴林，張俊清

(1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

益智不同提取物對水負(fù)荷多尿模型大鼠縮尿作用的研究

李永輝1，2，譚銀豐1，2，袁貴林2，張俊清1，2

(1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199)

目的 研究益智7種提取物對大鼠水負(fù)荷多尿模型大鼠的縮尿作用，并探討分析益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用水負(fù)荷多尿模型大鼠，對益智7種提取物進(jìn)行縮尿活性篩選，采用代謝籠測定大鼠尿量、首次排尿時間，并計(jì)算2 h排泄率；ELISA測定大鼠血清中CRH的含量。結(jié)果益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹脂90%洗脫物組和圓柚酮組可以明顯的降低2 h大鼠尿量(P＜0.05)，延長大鼠首次排尿時間(P＜0.05)，并能降低血清CRH的含量。結(jié)論益智的縮尿活性成分主要存在于益智果仁中，以圓柚酮為代表的倍半萜類成分可能是益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)。

益智；縮尿；活性成分；提取物

益智為姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥果實(shí)，是姜科山姜屬的常用中藥材，具有溫脾止瀉攝唾，暖腎固精縮尿的功效，臨床上用于治療虛寒腹瀉、遺尿等多種疾病[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智具有抗炎[3]、抗過敏[4]、抗?jié)僛5]和神經(jīng)保護(hù)作用[6-8]等多種藥理作用。益智的化學(xué)成分研究表明，倍半萜、二苯基庚烷和黃酮是益智中的主要成分類別[9-10]。

益智的傳統(tǒng)應(yīng)用多“去殼”使用，如《理傷續(xù)斷方》記載“去殼炒”，《炮炙大法》“去殼炒，臨用研”?！侗静菝审堋贰叭と∪?，研碎入藥，鹽煎?！?。清代《本草述鉤元》“去殼，或炒或煨，臨用研。而在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中益智多為全果使用，少見去殼后的益智仁。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)益智的果殼和果仁中化學(xué)成分差異較大，益智的倍半萜成分主要存在于益智果仁中，二苯基庚烷和黃酮類成分主要存在于益智果殼中[11]。因此在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們制備了7種益智提取物(成分)，運(yùn)用水負(fù)荷多尿模型大鼠對7種提取物(成分)的縮尿功效進(jìn)行了研究，以期揭示益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)，解釋益智傳統(tǒng)應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵，進(jìn)而為益智的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雄性，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2009-0012。

1.2 藥品與試劑 縮泉丸(湖南漢森制藥股份有限公司，批號130102)、益智藥材[產(chǎn)地海南瓊中，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院田建平副教授鑒定為姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥成熟果實(shí)]、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRH)ELSIA試劑盒(武漢華美生物科技有限公司，批號C0607980317)。

1.3 制備方法 (1)益智揮發(fā)油：益智粉碎后加6倍量水，采用水蒸氣蒸餾的方法提取揮發(fā)油，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(2)益智醇提物：益智粉碎后加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時間為1 h，減壓回收乙醇至無醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(3)益智果殼醇提物：益智粉碎后，以14目分樣篩篩選益智果殼，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時間為1 h，減壓回收乙醇至無醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(4)益智果仁醇提物：益智粉碎后，以14目分樣篩篩選益智果仁，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時間為1 h，減壓回收乙醇至無醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(5)益智大孔樹脂乙醇洗脫物：益智粉碎后，以8倍量的95%乙醇回流提取1 h，提取液減壓回收至無醇味，以2倍量的50%乙醇溶解，上HP-20大孔吸附樹脂，上樣2次，先以5倍量的50%乙醇洗脫，減壓回收50%乙醇洗脫液至無醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度，得益智大孔樹脂50%乙醇洗脫物，繼續(xù)以5倍量的90%乙醇洗脫，減壓回收90%乙醇洗脫液至無醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度，得益智大孔樹脂90%乙醇洗脫物；(6)圓柚酮：取圓柚酮化合物，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度。

1.4 方法

1.4.1 動物篩選 SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，仿Aston法對動物進(jìn)行篩選，即按照體重灌注去離子水22 ml/kg，使動物體內(nèi)水平衡。收集2 h尿液，尿量超過40%水負(fù)荷者為合格。

1.4.2 分組與給藥 取篩選合格的大鼠80只，按尿量、體重均勻分為正常組、模型組、縮泉丸組、益智揮發(fā)油組、益智醇提取組、益智果殼醇提取組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹脂50%乙醇洗脫物組、益智90%乙醇洗脫物組、圓柚酮組，每組8只動物。每組按5 ml/kg灌胃給藥10 d，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，分別于給藥前和末次給藥1 h后按25 ml/kg灌胃去離子水，正常組不給水負(fù)荷，擠盡膀胱余尿，置代謝籠中分別觀察給藥前和給藥后2 h尿量及首次排尿時間。試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠眼眶靜脈叢取血1 ml，分離血清，-80℃保存。縮泉丸給藥劑量為3.0 g/kg，益智各組給藥劑量為生藥7.5 g/kg，圓柚酮給藥劑量為60 ml/kg，相當(dāng)成人日服劑量的50倍。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，尿量的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對尿量的影響 與模型組比較，益智醇提取組、益智果仁醇提物組和圓柚酮組可以顯著降低大鼠2 h尿量，益智90%乙醇洗脫物組具有降低大鼠尿量的趨勢，見表1。

表1 益智各提取物(成分)對水負(fù)荷多尿模型大鼠尿量的影響(±s，n=8)

表1 益智各提取物(成分)對水負(fù)荷多尿模型大鼠尿量的影響(±s，n=8)

注：與模型組比較，aP＜0.01，bP＜0.05。

正常組模型組縮泉丸組益智揮發(fā)油組益智醇提物組益智果殼醇提物組益智果仁醇提物組益智大孔樹脂50%洗脫物組益智大孔樹脂90%洗脫物組圓柚酮組----3.0 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 60 mg/kg 0.92±0.68 4.85±1.04 3.92±0.93 5.21±1.13 3.15±0.86a5.05±1.02 3.47±0.83a4.35±1.32 3.48±1.12 3.28±1.06b19.18 -7.42 35.05 -4.12 28.45 10.31 28.25 32.37

2.2 益智各組(成分)對水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響 與模型組相比，各給藥組對大鼠首次排尿時間均有一定的延長，其中益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹脂90%洗脫物組和圓柚酮組對大鼠首次排尿時間影響較顯著(P＜0.05)。大鼠2 h平均尿量排泄率中，益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹脂90%洗脫物組和圓柚酮組的排泄率均小于70%，顯示該4組對大鼠尿量均有較好的“縮尿”作用，見表2。

表2 益智各組（成分）對水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響(±s，n=8)

表2 益智各組（成分）對水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響(±s，n=8)

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 劑量 首次排尿 平均尿量時間(min)排泄率(%正常組-45.13±8.53-模型組-14.85±5.1597.00縮泉丸組3.0 g/kg37.46±9.16a78.40益智揮發(fā)油組7.5 g/kg16.32±6.17104.20益智醇提物組7.5 g/kg31.56±5.29a63.00益智果殼醇提物組7.5 g/kg19.62±8.16101.00益智果仁醇提物組7.5 g/kg35.18±6.27a69.40益智大孔樹脂50%洗脫物組7.5 g/kg20.43±6.2787.00益智大孔樹脂90%洗脫物組7.5 g/kg29.29±5.38a69.60圓柚酮組60 mg/kg26.78±8.12a65.60 )

2.3 益智各組對大鼠血清CRH含量的影響 益智各給藥組對血清中CRH均有一定降低趨勢，尤其是益智果仁醇提物組和益智醇提物組下降較明顯，但是由于整體影響較小，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 益智各組對大鼠血清CRH含量的影響(±s，n=8)

表3 益智各組對大鼠血清CRH含量的影響(±s，n=8)

組別 劑量CRH(ng/ml)正常組-7.39±0.28模型組-7.24±0.31縮泉丸組3.0 g/kg7.01±0.23益智揮發(fā)油組7.5 g/kg7.32±0.18益智醇提物組7.5 g/kg6.32±0.19益智果殼醇提物組7.5 g/kg6.98±0.16益智果仁醇提物組7.5 g/kg6.20±0.23益智大孔樹脂50%洗脫物組7.5 g/kg6.98±0.17益智大孔樹脂90%洗脫物組7.5 g/kg6.52±0.13圓柚酮組60 mg/kg6.34±0.25

3 討論

益智果實(shí)由果殼和果仁兩部分組成，在傳統(tǒng)應(yīng)用中多為“去殼”使用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，益智果殼中主要含有二苯基庚烷和黃酮類化合物，益智果仁中主要含有倍半萜類化合物，結(jié)合傳統(tǒng)的“去殼”使用，可以推測縮尿的活性物質(zhì)可能存在于益智果仁中，倍半萜可能是其主要活性成分。大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，益智果仁提取物的縮尿活性明顯優(yōu)于益智果殼提取物，驗(yàn)證了“益智縮尿的活性成分主要存在于益智果仁中”的假設(shè)。結(jié)合倍半萜的代表性成分圓柚酮的縮尿?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)圓柚酮可以明顯的減少大鼠2 h尿量。因此可以基本確定益智中倍半萜類化合物對縮尿功效有較大貢獻(xiàn)。

在進(jìn)行大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，不同大鼠的排尿尿量和排尿時間的個體差異較大，部分大鼠在2 h內(nèi)不產(chǎn)生排尿。因此在實(shí)驗(yàn)前首先要對大鼠進(jìn)行尿量篩選，選擇2 h尿量超過40%水負(fù)荷的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

促腎上腺皮質(zhì)激素生成激素是由下丘腦神經(jīng)元合成，垂體分泌的一種激素。Darcie等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠鞘內(nèi)注射20 μg或腹腔注射20 mg/kg的CRH，可以增加膀胱收縮頻率和降低膀胱，進(jìn)而產(chǎn)生遺尿。本文選擇了CRH作為檢測指標(biāo)，對益智各提取物的縮尿機(jī)制進(jìn)行了探討，其中益智醇提物組、益智果仁醇提物組和益智大孔樹脂洗脫90%洗脫物組呈現(xiàn)了較明顯的降低血漿CRH的作用，提示益智縮尿與CRH有一定關(guān)系。

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Study on the urine reduction of seven extracts of Alpinia oxyphylla in water-loading diuresis model rats.

LI Yong-hui1,2,TAN Yin-feng1,2,YUAN Gui-lin2,ZHANG Jun-qing1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of Research and Development of Tropical Medicinal Plants,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of 7 kinds of extract ofAlpinia oxyphyllaon urine reduction of water-loading diuresis model rats,and to screen the urine reduction bioactive components ofAlpinia oxyphylla.MethodsUsing water-loading diuresis model rats,seven extracts ofAlpinia oxyphyllawere screened for their activity of urine reduction.The metabolism cage was used to determine the urine volume and the excretion time of rats.The 2 h excretion rate was calculated.The CRH content in rat serum was also determined by ELISA.ResultsThe ethanol extract ofA.oxyphylla,the ethanol extract ofA.oxyphyllaseed,the 90%ethanol elution of macroporous resin and nootkatone could significantly reduce the urine volume in 2 h(P＜0.05),prolong the first excretion time(P＜0.05), and decrease the contents of CRH in serum.ConclusionThe urine reduction bioactive components mainly exist inA.oxyphyllaseed,and the sesquiterpene compounds might be the material basis of urine reduction inA.oxyphylla.

Alpinia oxyphylla;Urine reduction;Bioactive components;Extrac

R-332

A

1003—6350（2015）08—1105—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0396

2014-10-09)

海南省自然科學(xué)基金(編號：813196)；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)(編號：ZDXM2014071)

張俊清。E-mail：jqzhang2011@163.com