張皓， 張小瓊，徐東炯，張翔

(江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001)

?

改良沉淀集卵法檢測固體中蛔蟲卵方法研究

張皓， 張小瓊，徐東炯，張翔

(江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001)

采用改良后的沉淀集卵法對低(10個/100 g)、中(20個/100 g)、高(40個/100 g)3種不同濃度的加標樣品進行蛔蟲卵檢測，比較其回收率。結(jié)果表明：不同濃度加標樣品的回收率為高濃度>中濃度>低濃度。與相關文獻實驗結(jié)果比較表明，該方法不僅回收率較高、穩(wěn)定性較好，且在檢測低濃度樣品時較漂浮集卵法具有一定優(yōu)勢。

沉淀集卵法；蛔蟲卵；加標樣品；回收率

蛔蟲感染與蛔蟲病是中國的嚴重公共衛(wèi)生問題[1]。固體廢棄物中的蛔蟲卵是人類感染蛔蟲病的主要來源之一，對固體廢棄物蛔蟲卵污染情況的調(diào)查，不僅是蛔蟲種群生態(tài)學與流行病學研究的主要內(nèi)容[2-4]，也是環(huán)境保護固體廢棄物管理的重要指標[5-10]。目前，國內(nèi)外無論哪種蛔蟲卵檢測方法對固體廢棄物中蛔蟲卵測定的檢出率都相對偏低[11-14]。為配合環(huán)境監(jiān)測工作的開展，探索出一種能有效提取出固體廢棄物中蛔蟲卵的檢測方法，在參考國內(nèi)主要集卵方法的基礎上，借鑒EPA(美國環(huán)保署)相關技術文件中介紹的分離方法[15]，整理出一套改良的沉淀集卵檢測方法，并通過該方法對不同濃度固體介質(zhì)中蛔蟲卵提取效果進行比較研究，進一步確認方法的可靠性及實用性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

根據(jù)哺乳動物糞便主要組成成分(表1)，采用相應介質(zhì)替代物按照相同比例充分混合攪拌后制成空白樣品。分別向空白樣品中添加不同數(shù)量的蛔蟲卵，制成低(10個/100 g)、中(20個/100 g)和高(40個/100 g)3種不同濃度的加標樣品，每種濃度的加標樣品設6個平行，然后通過改良的沉淀集卵法對所有加標樣品中的蛔蟲卵進行測定，比較各樣品的加標回收率。

1.2 實驗方法

1.2.1 加標樣品的制作

首先，選取活體雌性蛔蟲成蟲進行解剖[16-17]，將卵巢、輸卵管及子宮內(nèi)的蛔蟲卵全部收集到離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)添加直徑1 mm的玻璃珠數(shù)顆，旋緊瓶蓋后放在振蕩器上振蕩30 min，然后將管內(nèi)所有物質(zhì)通過60目篩網(wǎng)過濾，濾去殘渣。其次，將剩余物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一離心管，再次添加玻璃珠振蕩30 min，再將管內(nèi)物質(zhì)通過250目篩網(wǎng)過濾，濾去殘渣，剩余物質(zhì)轉(zhuǎn)移入收集蛔蟲卵的玻璃容器內(nèi)。為了實驗安全起見，將收集有蛔蟲卵的玻璃容器放置于80 ℃的水浴鍋內(nèi)1～2 h，對蛔蟲卵進行滅活處理，然后按照體積比加入適量的福爾馬林溶液固定保存。最后，將收集好蛔蟲卵的玻璃容器搖勻后，吸出1 mL放入計數(shù)框中，根據(jù)實驗設計的濃度要求在顯微鏡或高倍體視鏡下逐個吸出蛔蟲卵，加入空白樣品中，混勻，完成加標試樣的制備[18]。

首先，選取活體雌性蛔蟲成蟲進行解剖[16-17]，將卵巢、輸卵管及子宮內(nèi)的蛔蟲卵全部收集到離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)添加直徑1 mm的玻璃珠數(shù)顆，旋緊瓶蓋后放在振蕩器上振蕩30 min，然后將管內(nèi)所有物質(zhì)通過60目篩網(wǎng)過濾，濾去殘渣。其次，將剩余物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一離心管，再次添加玻璃珠振蕩30 min，再將管內(nèi)物質(zhì)通過250目篩網(wǎng)過濾，濾去殘渣，剩余物質(zhì)轉(zhuǎn)移入收集蛔蟲卵的玻璃容器內(nèi)。為了實驗安全起見，將收集有蛔蟲卵的玻璃容器放置于80 ℃的水浴鍋內(nèi)1～2 h，對蛔蟲卵進行滅活處理，然后按照體積比加入適量的福爾馬林溶液固定保存。最后，將收集好蛔蟲卵的玻璃容器搖勻后，吸出1 mL放入計數(shù)框中，根據(jù)實驗設計的濃度要求在顯微鏡或高倍體視鏡下逐個吸出蛔蟲卵，加入空白樣品中，混勻，完成加標試樣的制備[18]。

表1 實驗所用空白樣品與哺乳動物糞便成分對比 %

1.2.2 過濾離心

向加標樣品中加入500 mL去離子水，充分混勻后通過60目和250目的金屬篩網(wǎng)濾去樣品中大顆粒雜質(zhì)，再沉淀離心(1 000 g離心力離心15 min)收集以蛔蟲卵為主的固體沉淀物，然后依次向加標樣品中加入4 mL乙酸乙酯和4 mL乙酰乙酸(該步驟用以吸收樣品中的脂類物質(zhì))，再次離心后分層，棄去上層和中層雜質(zhì)，剩下底層沉淀物留作鏡檢使用[18]。

1.2.3 鏡檢

向處理好的樣品管內(nèi)緩慢加入飽和硝酸鈉溶液(加入量不得少于沉淀物的20倍)，用移液槍將離心管內(nèi)的沉淀物與飽和硝酸鈉溶液充分混勻，吸取混懸液加入到5 mL或者1 mL的生物技術框內(nèi)，靜置5～10 min后(讓蛔蟲卵充分漂浮)，再在顯微鏡或高倍體視鏡下記錄蛔蟲卵數(shù)量[18]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL統(tǒng)計分析軟件對各組樣品的回收結(jié)果進行統(tǒng)計，計算各平行樣間的標準偏差，和各樣品的加標回收率。

2 結(jié)果與討論

實驗結(jié)果顯示：低、中、高3種濃度的平行樣間標準偏差分別是0.75、1.72和1.47個/102g，相對標準偏差分別為34.7%、29.5%和12.1%；而3種濃度加標樣品的加標回收率分別是21.7%、29.2%和30.4%?？梢钥闯?，改良的沉淀集卵法對3種濃度中蛔蟲卵提取的效果依次是高濃度>中濃度>低濃度，不同濃度加標樣品蛔蟲卵檢測結(jié)果見表2。

表2 不同濃度加標樣品蛔蟲卵檢測結(jié)果

將檢出結(jié)果與現(xiàn)有文獻記載的結(jié)果進行比較： 1994年，南昌寄生蟲教研室崔曉明和周憲明[19]向干凈的土壤樣品中添加不同數(shù)量(4 ～400個/5 g)的蛔蟲卵，并通過漂浮集卵法對蛔蟲卵的檢出率進行測定。結(jié)果顯示，各濃度組蛔蟲卵的平均回收范圍在5.5%～42.6%，且濃度越高的樣品，其蛔蟲卵回收率越高，這一結(jié)果與實驗結(jié)果相符。而由于實驗中所用加標樣品量為100 g，遠高于前者實驗中的樣品量(5 g)，這在一定程度上增加了實驗過程中蛔蟲卵損失的可能性，增加了檢出難度。從實驗最終結(jié)果來看，該實驗的回收率為21.7%～30.4%，相對于前者的實驗結(jié)果，雖然最高回收率低于前者，但各濃度回收率間差異不大，回收率波動范圍較小，方法穩(wěn)定性較高。此外，錢穎駿等[20]也曾對傳統(tǒng)漂浮集卵法進行改良探索，比較了4種不同的漂浮試劑對土壤中蛔蟲卵的分離效果，蛔蟲卵的檢出率范圍為0.19%～25.49%，相比之下，該實驗的蛔蟲卵回收效果更好。1995年，AJALA[21]用鹽水漂浮集卵法對不同濃度的土壤樣品(500 ～10 000個/25 g)進行蛔蟲卵檢出率測定比較，最大檢出率也僅為 25.04%，與之相比，本實驗的檢出率更好。綜上說明，本次實驗采用的改良沉淀集卵法穩(wěn)定性要較漂浮集卵法高，尤其對于低濃度樣品的檢測，具有一定的優(yōu)勢。

3 結(jié)語

通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，改良的沉淀集卵法對低、中、高3種濃度加標樣品中蛔蟲卵的分離效果依次為高濃度>中濃度>低濃度，其中最高回收率達到30.4%，且不同濃度間回收率波動較小。該結(jié)果與現(xiàn)有文獻記載的各種固體蛔蟲卵檢測方法的回收率比較，具有一定優(yōu)勢，而隨著蛔蟲卵數(shù)量的增多，漏檢率會進一步下降，回收率有可能進一步上升，有待后續(xù)論證。改良后的沉淀集卵法不僅精簡了原EPA分離方法的實驗步驟，縮短了實驗時間，而且選擇了更加通用的實驗器材和設備，降低了實驗成本，使該方法更便于在國內(nèi)推廣。就實驗結(jié)果來看，改良后的沉淀集卵法回收效果并沒有下降，且方法的穩(wěn)定性較高，尤其在低濃度樣品的檢測中表現(xiàn)較漂浮集卵法更為出色。

[1] 全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查辦公室.全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查報告[J] .中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2005,23 (增刊) :332-334.

[2] 詹希美編.人體寄生蟲學[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

[3] 孔繁瑤編.家畜寄生蟲學[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,1997.

[4] 許隆祺,蔣則孝,余森海，等.人體常見三種土源性線蟲感染與土壤污染調(diào)查[J] .中國寄生蟲病防治雜志,1994 ,7(3):171-173.

[5] 國家環(huán)境保護總局.GB 7959-1987 糞便無害化衛(wèi)生標準[S].北京：中國標準出版社，1987.

[6] 國家環(huán)境保護總局, 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB 18466-2005 醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標準[S].北京：中國標準出版社,2005.

[7] 國家環(huán)境保護總局, 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB 18596-2001 畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標準[S].北京：中國標準出版社,2001.

[8] 國家環(huán)境保護總局.GB 8172-1987 城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準[S].北京：中國標準出版社,1987.

[9] 俞梁敏,徐燕,王婷.典型外向型經(jīng)濟地區(qū)農(nóng)村固體廢棄物污染處置狀況與管理對策[J].環(huán)境監(jiān)控與預警,2014,6(2):55-58.

[10] 杜敏敏,黃衛(wèi).以污染源普查結(jié)果芻議環(huán)境問題與對策建議[J].環(huán)境監(jiān)控與預警,2010,2(3):52-56.

[11] 朱俊勇,張明華,郭楓.寄生蟲卵飽和鹽溶液浮聚法的比較研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志,2002 ,15 (2):173.

[12] GEENEN P L,BRESCIANI J,BOES J,et al.The morphogenesis of Ascaris suum to the infective third-stage larvae within the egg[J].Parasital,1996,85(4):616-622.

[13] 李鵬.出口泡菜中人畜共患寄生蟲卵的檢測與處理[J].衛(wèi)生檢驗,2007(1):33.

[14] MAYA C, JIMENEZ B, SCHWARTZBROD J.Comparison of Techniques for the Detection of Helminth Ova in Drinking Water and Wastewater[J].Water Environment Research, 2006,78(2):118-124.

[15] EPA.EPA/625/R-92/013 Environmental Regulations and Technology, Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge[S].2003.

[16] 陳佩惠編.人體寄生蟲學實驗技術[M].北京:科學出版社，1988.

[17] 白功懋.寄生蟲與寄生蟲檢驗學[M] .北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1989.

[18] 張皓, 張小瓊，張翔，等.改良的沉淀集卵法分離四種不同固體介質(zhì)中蛔蟲卵效果的比較研究[C]//中國環(huán)境科學學會學術年會論文集：2013.

[19] 崔曉明, 周憲民.大量土壤樣本中蛔蟲卵的檢測方法初探[J].江西醫(yī)學院學報,1994,34(3):20.

[20] 錢穎駿,諸廷俊，王聚君，等.4種漂浮法分離土壤中人蛔蟲卵的效果比較[J].中國病原生物學雜志, 2008,3(4):305-306.

[21] AJALA M.The separation results of Ascaris eggs with Floating in the soil salt[J].Helminthol, 1995,69(1):1-6.

Modified Sedimentation Method of Collecting Eggs for Detection of Ascaris Eggs in Various Solid Matrices

ZHANG Hao, ZHANG Xiao-qiong, XU Dong-jiong, ZHANG Xiang

(JiangsuEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryforAquaticBiomonitoring,ChangzhouEnvironmentalMonitoringCenter,Changzhou,Jiangsu213001,China)

Modified sedimentation method was applied for detecting ascaris eggs in low (10 eggs per 100g), medium (20 eggs per 100g) and high (40 eggs per 100g) concentrations. Comparison of the recoveries at these three different spiked levels, high concentration ones had the highest recovery, followed by medium concentration ones, and low concentration ones.Compared with the experimental results in references,the recovery of this method was higher, and the stability was better. Also，this method was more appropriate for detecting samples in low concentration than flotation method.

Sedimentation method of collecting eggs; Ascaris eggs; Spiked samples; Recovery

2014-05-27;

2014-06-11

環(huán)境標準制修訂專項項目(1130)

張皓(1984—)，男，工程師，碩士，主要從事生物多樣性和生態(tài)毒理方面的研究工作。

R383.1+1

B

1674-6732(2015)02-0017-03