張蓓蓓，張立志，章勇

(1.國家環(huán)境保護地表水環(huán)境有機污染物監(jiān)測分析重點實驗室，江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

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·監(jiān)測技術·

水中草甘膦和氨甲基膦酸的柱前衍生-液相色譜方法研究

張蓓蓓1，張立志2，章勇1

(1.國家環(huán)境保護地表水環(huán)境有機污染物監(jiān)測分析重點實驗室，江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

建立柱前衍生-液相色譜-熒光檢測法同時測定水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法。水樣經(jīng)芴甲氧羰酰氯衍生化后取上清液進樣，采用ODS C18柱，以水(5 mmol/L乙酸銨)-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，采用熒光檢測器進行檢測。實驗通過加入檸檬酸三鈉，解決了實際水樣中金屬陽離子的干擾問題。草甘膦和氨甲基膦酸在一定范圍內(nèi)線性良好(r=0.997 3～0.999 0)，回收率為92.2%～102%，相對標準偏差為4.3%～8.5%，方法檢出限為1.29 μg/L和1.84 μg/L。

草甘膦；氨甲基膦酸；芴甲氧羰酰氯柱前衍生；柱前衍生-液相色譜法；地表水

草甘膦(Glyphosate，PMG)，化學名為N-膦羧基甲基甘氨酸，是一種廣譜、非選擇性、內(nèi)吸傳導性強的除草劑。隨著轉(zhuǎn)基因抗草甘膦農(nóng)作物的增多，草甘膦已成為世界上應用最廣、產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。草甘膦具有強極性、低揮發(fā)性的特點，導致其難以氣化，且在常規(guī)反相柱上沒有保留，難以利用氣相色譜(GC) 和高效液相色譜(HPLC) 進行分離測定。此外，由于缺少生色基團，難以直接利用紫外和熒光檢測器進行檢測。草甘膦的代謝物為氨甲基膦酸(Aminomethyl phosphonic acid，AMPA)，其極性與水溶性不利于對它進行提取。

目前，《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750-2006)以及EPA 547方法測定環(huán)境水體中草甘膦和氨甲基膦酸均采用柱后衍生離子交換色譜法，操作繁瑣且不易掌握。國內(nèi)外文獻報道的檢測方法主要包括離子色譜法[1-3]、柱前或柱后衍生-液相色譜法[4-5]、柱前衍生-氣相色譜法[6-7]或氣質(zhì)譜聯(lián)用法[8]和液相色譜質(zhì)譜法[9-13]等。但采用質(zhì)譜檢測，儀器設備昂貴，不易推廣，因此，建立了較易推廣的柱前衍生-液相色譜-熒光檢測法。草甘膦結(jié)構(gòu)中存在較多的活性位點，易與多價金屬陽離子發(fā)生絡合反應[14-17]。在大量飲用水源地實際樣品測定中也發(fā)現(xiàn)，部分實際樣品加標后回收率很低，因此在方法研究中著重考察了水中多價陽離子對草甘膦及氨甲基膦酸測定的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜/熒光檢測器(Waters 2695/2475)；Empower 3.0 工作站；水浴機(LAUDA公司)；Milli-Q超純水器(美國 millipore公司)；渦旋混合器(日本 LMS公司)。

試劑：草甘膦(PMG，純度97.0%)；氨甲基膦酸(AMPA，純度98.3%)，購于Dr. Ehrenstorfer 公司；甲醇；乙腈 (色譜純，Merck公司)；乙酸銨(色譜純)；純化水(Millipore)；檸檬酸三鈉(分析純) ；磷酸(分析純)；四硼酸鈉(分析純)；芴甲氧羰酰氯(FMOC，色譜純)。

1.2 色譜分析條件

ODS C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為水-5 mmol/L乙酸銨(A相)和乙腈(B相)，采用梯度洗脫模式，0 min，A∶B =90∶10(V/V)，保持2 min；到8 min時，梯度比例變?yōu)锳∶B =50∶50(V/V)；到10 min時，梯度比例變?yōu)锳∶B =0∶100(V/V)，保持2 min；到14 min時，梯度比例變回初始比例A∶B =90∶10(V/V)，保持1 min。流速 1.0 mL/min，進樣量 20 μL，色譜柱溫為 25 ℃。熒光檢測器激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長 315 nm。

1.3 樣品制備

在10 mL玻璃具塞試管中，取1.0 mL水樣，加入100 μL 5%檸檬酸三鈉水溶液(m/V)并混勻；加入0.5 mL的0.05 mol/L四硼酸鈉水溶液和0.5 mL的0.1% FMOC乙腈溶液(m/V)，塞上試管蓋，充分振蕩，放入40℃恒溫水浴中反應15 min；取出試管，加入0.5 mL的2%磷酸水溶液(V/V)以中止反應；加5 mL二氯甲烷渦旋萃取2 min，取水相層；上機前過0.45 μm針頭過濾器。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同極性萃取溶液比較

配制相同濃度的水樣，經(jīng)過衍生化反應后，比較不加萃取溶劑直接過濾進樣、加入乙酸乙酯萃取后過濾進樣、加入正己烷萃取后過濾進樣和加入二氯甲烷萃取后過濾進樣四種不同極性萃取溶液對衍生化副產(chǎn)物的去除效果。結(jié)果表明，不加萃取溶劑直接過濾進樣，樣品中干擾物質(zhì)較多，衍生化反應副產(chǎn)物響應很高。而采用正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷分別萃取，副產(chǎn)物去除能力依次增強，對目標物亦無損失。同時針對實際水樣，采用二氯甲烷作為萃取劑可以較大范圍的去除一些不必要的有機干擾物，從而選擇二氯甲烷作為萃取劑。

2.2 多價陽離子對目標物的影響考察

對實際水樣草甘膦檢測分析，結(jié)果表明，有些實際水樣經(jīng)加標后回收率非常低，而同時采用純水加標回收率均正常。查閱文獻可知，草甘膦具有與多價陽離子配位絡合的活性點，實際樣品加標回收率低可能與樣品中含有一定濃度的多價陽離子有關。因此，著重考察了水樣中Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+對PMG和AMPA檢測分析的影響。

根據(jù)自然環(huán)境水體中金屬離子濃度水平，配制了含有不同濃度、不同種類的多價金屬陽離子的水樣以及純水樣品，分別加入一定濃度PMG和AMPA，避光過夜放置24 h后，進行檢測分析，以考察多價金屬陽離子對目標化合物是否有影響。具體實驗過程：取1.0 mL水樣于10 mL玻璃具塞試管中，加入0.5 mL的0.05 mol/L四硼酸鈉和0.5 mL的0.1% FMOC，塞上試管蓋，充分振蕩，放入40 ℃恒溫水浴中反應30 min；取出試管，加入0.5 mL的2%磷酸溶液以中止反應；加5 mL二氯甲烷渦旋萃取2 min，取水相層；上機前過0.45 μm針頭過濾器，結(jié)果見表1。由表1可見，ρ(Cu2+)達到0.05 mg/L以上時，對PMG有明顯絡合能力，影響水體中PMG的測定，但對AMPA無顯著影響；而其他陽離子在設定濃度水平下對兩個目標物的測定均沒有明顯影響。

2.4 金屬螯合劑的選擇

實驗發(fā)現(xiàn)，水體中存在Cu時會和PMG發(fā)生絡合，并顯著影響PMG的測定。因此，采用金屬螯合劑來競爭水體中的Cu2+及其他金屬陽離子，以釋放PMG從而實現(xiàn)準確定量。

表1 水體中多價陽離子對目標物測定的影響考察(n=6) %

實驗研究了在衍生化之前，加入EDTA、酒石酸鉀鈉及檸檬酸三鈉的影響。結(jié)果表明，加入EDTA和酒石酸鉀鈉，雖然對Cu2+有較好絡合能力，但對目標物PMG會產(chǎn)生較大的副產(chǎn)物干擾峰，而檸檬酸三鈉既可以很好的競爭絡合Cu2+，又對兩個目標物沒有干擾。因此采用檸檬酸三鈉作為實驗的金屬螯合劑。同時，按照檸檬酸三鈉與金屬陽離子最弱絡合比例(摩爾比1∶1)來計算，1 mL水體中加入5%檸檬酸三鈉100 μL，已完全過量，可以滿足對自然水體中金屬陽離子的充分絡合。

2.5 衍生化反應溫度和時間優(yōu)化

根據(jù)1.3節(jié)中樣品制備過程，分析了不同反應溫度(常溫、40℃和60℃)和時間(0 、5 、15 、30 、60 和120 min)對衍生化效率的影響，見圖1(a)(b)。由圖1可見，在水浴溫度40℃和60℃條件下，反應時間為5～30 min，PMG和AMPA具有較高的衍生化效率，因此選擇40 ℃衍生化溫度，15 min反應時間。

2.6 工作曲線與檢出限

配制質(zhì)量濃度依次為10.0、20.0、50.0、100、200和500 μg/L的PMG和AMPA水樣(此為參考濃度序列)，按照1.3節(jié)樣品制備過程處理后進行檢測分析，結(jié)果見表2。由表2可見，在該濃度范圍內(nèi)2種組分的相關系數(shù)均 > 0.995。2種目標物經(jīng)衍生后的標準色譜圖見圖2。

圖1 衍生化效率考察

表2 PMG和AMPA的線性方程

2.7 方法檢出限

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標準制修訂 技術導則》(HJ/T 168-2010)空白實驗中未檢出目標物質(zhì)的檢出限測定方法，以5.00 μg/L的水樣濃度作為檢出限測定的濃度，配制7份平行水樣。經(jīng)全過程分析，計算其濃度的標準偏差S。以3.143S為檢出限(LOD)，4倍檢出限為定量下限(LOQ)，結(jié)果見表3。由表3可見，2種目標物的檢出限為1.29、1.84 μg/L，該方法檢出限遠遠低于國家控制標準限值。

圖2 2種目標物經(jīng)衍生后的標準色譜圖

2.8 方法的精密度及回收率

選擇具有典型性的地表水樣(含有Cu2+0.114，F(xiàn)e3+0.008 ，Zn2+0.032，Ca2+138 mg/L)進行加標回收率測定，加標后兩個質(zhì)量濃度水平分別為20.0、200.0 μg/L，每個添加水平平行配制6份樣，其加標回收率及精密度分析結(jié)果見表4。由表4可見，2種目標物的回收率在92.2%～102%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差在4.3%～8.5%之間，方法的準確度和精密度均符合痕量分析的要求。

表3 方法檢出限計算結(jié)果(n=7) μg/L

表4 2種目標化合物的回收率、精密度(n=6)

3 結(jié)語

建立了柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測法分析水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法，該法操作簡便、靈敏度高、準確性好的特點，且很好地排除了地表水中金屬陽離子的干擾，在定性和定量上更加精確可靠，適合大批量地表水樣品的快速分析。

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Coupling Pre-column Derivatization with High Performance Liquid Chromatography for Determination of Glyphosate and AminomethylPhosphonic Acid in Water

ZHANG Bei-bei1, ZHANG Li-zhi2, ZHANG Yong1

(1.StateEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryofMonitoringandAnalysisforOrganicPollutantsinSurfacewater,EnvironmentalMonitoringCenterofJiangsuProvince,Nanjing,Jiangsu210036,China; 2.NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095,China)

A method for simultaneous determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid residues in water was developed by pre-column derivatization followed with high performance liquid chromatography (HPLC)-fluorescence detection. 9-Fluorenylmethyl chloroformate was selected as the derivatization reagent. After derivatization and extraction, the upper aqueous phase was analyzed. HPLC was achieved on an ODS C18 column by linear gradient elution using 5 mmol ammonium acetate-acetonitrile as the mobile phase, and fluorescence detector was used for detection. By adding trisodium citrate, the interference from metal cations was effectively eliminated. The results showed that good linear relationships (r=0.997 3～0.999 0) were exhibited in the range 10.0～500 μg/L for both compounds. The recoveries ranged from 92.2% to 102%, with the relative standard deviations of 4.3%～8.5%. The detection limits were 1.29 μg/L and 1.84 μg/L for glyphosate and aminomethylphosphonic acid, respectively. This method was simple, rapid, sensitive and accurate. It was suitable for simultaneous determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in surface water.

Glyphosate; Aminomethylphosphonic acid; 9-Fluorenylmethyl chloroformate; Pre-column derivatization; Surface water

2014-10-08；

2014-10-11

江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金資助項目(1301)

張蓓蓓(1982—)，女，高級工程師，碩士，主要從事環(huán)境監(jiān)測科研工作。

O657.7+2

B

1674-6732(2015)02-0013-04