楊林 謝瑤 孫志偉 秦文

胡頹子屬（Elaeagnus L）植物在全世界約有80余種，在我國約有55種，是胡頹子科中種類最多，分布最廣的屬，其主要分布在長江流域及其以南地區(qū)，植物資源比較豐富[1-2]。和沙棘屬植物相比，胡頹子屬植物資源更為豐富，其中很多品種除了具有藥食兩用價值外，還具有環(huán)保價值和觀賞價值。目前針對胡頹子屬的植物資源研究，國內主要圍繞其生藥學、分布學等方面，國外則更側重于分子生物學和其共生根瘤菌的研究[3-4]。

宜昌胡頹子為胡頹子科胡頹子屬常綠灌木，又名羊奶子、紅雞踢香。宜昌胡頹子集食用、藥用和觀賞價值于一體，是非常珍貴的藥食兩用植物。其果實含有豐富的鉀，可調節(jié)人體的血液滲透壓，可作為飲料補充人體的無機鹽損失。其根、葉和果實均可入藥，常用于治療肺虛氣短、疥瘡、痢疾、吐血、腦血栓等疾病[5]。同時宜昌胡頹子容易修剪，外形漂亮，常作為庭院觀賞植物。

近年來隨著人們對胡頹子屬植物的關注和深入研究，其更多的藥用價值和經(jīng)濟價值被人們所發(fā)現(xiàn)。雖然對胡頹子屬植物的次生代謝產物的研究在國外有了一定進展，而國內卻少有人探究，尤其是對宜昌胡頹子的研究更少，主要集中在生藥學、栽培種植和藥用價值等方面[6-8]。除了少量關于微量元素成分及揮發(fā)油的分析研究外，藥理作用和化學成分的研究報道少之又少[9-13]。因此，為進一步推動我國胡頹子屬植物資源的更深層次利用和開發(fā)，本文采用高效液相色譜（HPLC）法對宜昌胡頹子根中的槲皮素含量進行了測定，以期為該品的質量評價、質量控制及進一步開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)，為今后更好綜合利用開發(fā)宜昌胡頹子的植物資源提供參考，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent G1314 VWD檢測器，HP化學工作站（美國Agilent公司）；Sartorius BT224S電子天平（北京賽多力斯儀器公司）；BNX-1000超聲波清洗儀（蘇州比能信電氣有限公司）。胡頹子根采自湖北宜昌市秭歸縣，經(jīng)湖北三峽職業(yè)技術學院楊先哲副教授鑒定為真品，標本現(xiàn)存于湖北三峽職業(yè)技術學院藥學標本室。槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200908）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為自制重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；洗脫程序：0~35 min，流動相A相的比例由38%上升至95%；流速1 mL/min；檢測波長238 nm；柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 （1）對照品儲備液的制備：精密稱取槲皮素對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）對照品溶液的制備：精密量取對照品儲備液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。1.2.3 供試品溶液的制備 將宜昌胡頹子根干燥并粉碎，過60目篩。稱取宜昌胡頹子根干粉4.0 g置于50 mL燒瓶中，先用32 mL石油醚于50 ℃回流提取1.5 h，濾過；濾渣中再加入24 mL石油醚于50 ℃回流提取1 h，減壓過濾，收集濾液，揮干石油醚，干燥，備用[14]。精密稱取上述方法脫脂的胡頹子根粉末約1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入25%鹽酸-75%乙醇（1：4）混合溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足失重，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.4 HPLC法各項性能檢測 （1）系統(tǒng)適用性：取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按“1.2.1”條色譜條件檢測。（2）線性關系：精密吸取對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0和 5.0 mL，，分別置 10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得系列標準溶液，按“1.2.1”條色譜條件測定，以槲皮素峰面積A為縱坐標，質量濃度ρ為橫坐標，進行線性回歸。（3）精密度：精密吸取上述對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，按“1.2.1”項色譜條件測定。（4）穩(wěn)定性：取“1.2.2”項下供試品溶液，分別于制備后第0、2、4、6、8 h進樣，每次10 μL，按“1.2.1”項下色譜條件測定。（5）重復性：稱取5份同一批宜昌胡頹子根粉末各約1 g，精密稱定，分別按“1.2.3”項下方法平行制備5份供試品溶液，再按“1.2.1”項下色譜條件測定峰面積并計算樣品含量。（6）加樣回收率：取已知槲皮素含量（1.27 mg/g）的胡頹子根粉末各約1.0 g，精密稱定，照“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，總共9份，分別精密加入對照品儲備液2、2.5、3 mL，各3份，按“1.2.1”項下色譜條件分析，計算回收率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行線性回歸分析。

2 結果

HPLC法各項性能均較好，（1）系統(tǒng)適用性：槲皮素對照品與其他色譜峰分離良好，理論板數(shù)大于5000（圖1）。（2）線性關系：其回歸方程為A=23931ρ+54.3，相關系數(shù)r=0.9999，表明在10~50 μg/mL范圍內槲皮素質量濃度ρ與峰面積A值呈良好的線性關系。（3）精密度：計算槲皮素峰面積的RSD為0.03%，表明方法精密度良好。（4）穩(wěn)定性：計算槲皮素峰面積的RSD為1.02%，表明供試品溶液在室溫放置8 h穩(wěn)定性良好。（5）重復性：樣品平均含量為1.27 mg/g，RSD=1.68%，表明該方法重復性良好。（6）加樣回收率：平均回收率為99.66%，RSD=0.67%，見表1。

圖1 高效液相色譜圖注：A為對照品，B為供試品

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸等多種配比的流動相進行比較，結果顯示，使用乙腈-水體系時，出峰時間較早，峰形較鈍。當采用洗脫能力較弱，黏度較大的甲醇-水體系洗脫時，各峰分離度顯著提高。為了進一步使峰形改善，筆者在流動相中使用了磷酸溶液，結果顯示當磷酸的體積分數(shù)達到0.1%時，各峰峰形對稱，且分離度均大于2.0，故確定甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相。

表1 加樣回收率試驗結果

3.2 梯度洗脫依據(jù) 當采用等度洗脫時，槲皮素的分離度和理論踏板數(shù)并不理想，相鄰色譜峰之間分離度≤1.2，而改用梯度洗脫后槲皮素峰的分離效果顯著提高，理論塔板數(shù)大于6000，相鄰色譜峰間分離度良好，保留時間適中，故確定使用梯度法進行洗脫[15-16]。

3.3 最大吸收波長的選擇 筆者對槲皮素對照品溶液與宜昌胡頹子根供試品溶液分別進行了紫外吸收光譜掃描，結果發(fā)現(xiàn)二者均在238 nm波長附近有最大吸收，故確定檢測波長為238 nm。

3.4 宜昌胡頹子粗粉的處理 宜昌胡頹子中的揮發(fā)油是宜昌胡頹子中一類含量較高的成分，如果采取醇直接提取宜昌胡頹子中的黃酮類成分，不僅導致黃酮類成分提取不充分，也無法保證HPLC測定時進樣量的一致。因此本實驗中，筆者采用石油醚預先脫去宜昌胡頹子根干粉中的油脂，可提高黃酮類化合物的提取率和測定的準確性[17]。

3.5 供試品溶液的制備方法及提取溶劑的選擇 由于宜昌胡頹子中槲皮素主要以苷的形式存在，經(jīng)醇直接提取后進行HPLC測定，含量將無法達到HPLC的最低檢測限要求，故必須經(jīng)過酸水解將苷轉化為苷元后再進行測定[18]。因此，在提取過程中，采用鹽酸將苷完全轉化為苷元后再進行HPLC測定，槲皮素含量顯著提高。本實驗結果表明，用25%鹽酸-75%乙醇（1∶4）提取的槲皮素含量較高，色譜峰分離度好，故選用25%鹽酸-75%乙醇（1∶4）作為提取溶劑[19]。

湖北擁有豐富的胡頹子資源，但沒有現(xiàn)成的標準對宜昌胡頹子進行質量控制，本文采用HPLC法測定槲皮素的含量，方法簡便、準確、重復性好，為完善和提高宜昌胡頹子的質量控制標準提供了科學的依據(jù)。

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