王勛松 唐俊 黃秀珍 袁水斌 歐陽恭華

殼聚糖（Chitosan，CS）是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物，來源于甲殼動物和昆蟲的外骨骼，在地球上含量極為豐富。作為自然界中廣泛存在的一種天然多陽離子化合物，殼聚糖具有生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等多種優(yōu)良性能，使其在各行各業(yè)中得到廣泛關(guān)注。已有大量的研究提示，殼聚糖在體內(nèi)、體外對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等均有抑制作用[1]。本實驗通過對殼聚糖進行磷酸降解制備低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物，以殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物制作兩種水溶性婦科醫(yī)用敷料，并同時對他們進行抑菌實驗來研究低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物及其婦科醫(yī)用敷料的抑菌效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 殼聚糖（脫乙酰度95%以上）、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、聚乙烯醇及明膠均購自南通興成生化有限公司，95%乙醇、磷酸均為分析純。所用水為去離子純水，水解酪蛋白液體培養(yǎng)基、水解酪蛋白固體培養(yǎng)基、真菌藥敏培養(yǎng)基（RPMI 1640）及營養(yǎng)肉湯購自鄭州博賽生物科技有限公司。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；THZ-95恒溫振蕩儀；濁度儀；低速離心機。標準菌株：大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、白色念珠菌（ATCC10231）均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 方法

1.2.1 低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物的制備 （1）取一潔凈燒杯，加入80 mL去離子水，然后加入20 mL磷酸，配成含20%磷酸水溶液。（2）取脫乙酰度為95%以上的殼聚糖10 g溶于100 mL的20%磷酸溶液（20 mL磷酸+80 mL水）中，混勻后，置于約85 ℃恒溫振蕩儀邊攪拌邊振蕩混勻。2 h后，加入同等量的95%乙醇，攪拌混勻，這時有白色絮狀物質(zhì)析出，繼續(xù)攪拌直到白色絮狀物質(zhì)不再析出為止。（3）在加熱降解2 h后，將前面磷酸降解后的殼聚糖溶液分裝到規(guī)格為1.5×10 cm的塑料試管中，每管5 mL，然后各管分別再加入5 mL無水乙醇，充分振蕩攪勻后，析出白色絮狀物質(zhì)沉淀，放置低速離心機里3000 rpm離心5 min，離心完后取出試管將上清液倒棄，留下的沉淀物試管中再加入5 mL的無水乙醇，振蕩混勻后，再3000 rpm離心5 min，如此洗滌3次后，棄去上清液后，將只剩有沉淀的塑料試管放置于37 ℃溫箱底部讓剩下的水分蒸發(fā)掉，烘干后試管倒出的粉末即為制備的低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物。該產(chǎn)物粉末溶于水后pH為4.0。

1.2.2 醫(yī)用栓劑敷料的制作 （1）稱取低分子量殼聚糖酸解產(chǎn)物100 mg置于試管中，再加入20 μL磷酸和0.3 mL水，置于80 ℃水浴箱水熱約10 min，待完全澄清后取出。（2）再分別稱取聚乙二醇4000型1.2 g和聚乙二醇400型1.2 g加入前面試管中，繼續(xù)放置80 ℃水浴加熱，至澄清后取出。（3）然后立即用粗口徑滴管吸取混合液滴到直徑6 mm的每個微板小孔中2滴，待冷卻后凝固成白色軟固狀物，即為殼聚糖酸解產(chǎn)物醫(yī)用栓劑敷料實驗用小塊。

1.2.3 醫(yī)用水凝膠式敷料的制作 （1）稱取0.4 g低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物置于玻璃試管中，加入20 μL磷酸和1 mL去離子水，攪勻后置于80 ℃水浴箱水浴10 min后，再用振蕩儀振蕩攪勻至完全溶解變透明溶液后取出。然后加入3 mL水和1 mL甘油，混勻。（2）稱取0.8 g藥用明膠加入到小燒杯中，再加入5 mL去離子水，放置80 ℃水浴箱水浴并不時攪拌，直到變成均勻懸濁液為止。（3）將上述兩步的液體倒在一起混勻，再加入0.8 g聚乙烯醇，邊加邊攪拌配成均勻的混合液體，然后置80 ℃水浴箱水浴5 min形成凝膠狀物質(zhì)，即為可用殼聚糖酸解產(chǎn)物醫(yī)用水凝膠敷料。

1.2.4 低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物最小抑菌濃度測定 分別稱取1024 mg的低分子量殼聚糖產(chǎn)磷酸降解產(chǎn)物，溶于1 mL無菌生理鹽水中配成濃度為1024 mg/mL低分子量殼聚糖產(chǎn)磷酸降解產(chǎn)物原液。再對原液行對倍稀釋使其最終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 mg/mL， 最 后一管為對照。分別加入0.05 mL的經(jīng)培養(yǎng)18~24 h的1.5×106CFU/mL（0.5麥氏濁度稀釋100倍）的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌菌懸液，混勻后放置35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h后，再分別吸取0.05 mL混合液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌接種于沙保羅培養(yǎng)基中，把接種好的培養(yǎng)基放置35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后取出培養(yǎng)基讀取結(jié)果，分別觀察不同濃度的培養(yǎng)基的細菌菌落生長情況。以不生長形成菌落的濃度為最小抑菌濃度。

1.2.5 低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用敷料的抑菌實驗 分別在水解酪蛋白固體培養(yǎng)基（M-H培養(yǎng)基）和真菌藥敏專用培養(yǎng)基（RPMI 1640培養(yǎng)基）用金屬打孔器打3個直徑6 mm的圓形凹杯孔，M-H培養(yǎng)基涂布制備好的0.5麥氏濁度的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌懸液，RPMI 1640培養(yǎng)基涂布0.5麥氏濁度白色念珠菌菌懸液。然后一孔加入低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用栓劑敷料一片，一孔加入低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用水凝膠敷料0.1 mL，第3孔做對照。把抑菌實驗的培養(yǎng)基放置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)24 h后觀察3個孔周圍的細菌生長情況，以無細菌生長的最大直徑為抑菌直徑。測定低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用敷料對細菌的抑菌環(huán)直徑，用以判斷低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用敷料的抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖酸降解產(chǎn)物最小抑菌濃度 通過肉湯稀釋法測定低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對大腸埃希菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對白色念珠菌的最小抑菌濃度都為0.5 mg/mL。

2.2 殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物敷料的抑菌效果 經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，藥敏培養(yǎng)基上低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物醫(yī)用栓劑敷料和醫(yī)用水凝膠敷料在金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌培養(yǎng)基的小孔周圍形成比較清晰的抑菌環(huán)，兩種低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物制備的醫(yī)用敷料對標準菌種的抑菌環(huán)直徑見表1。

表1 兩種醫(yī)用敷料對標準菌株的抑菌環(huán)直徑 mm

3 討論

殼聚糖的抑菌作用是保證殼聚糖抑菌敷料臨床應(yīng)用療效的前提和關(guān)鍵。近年來，隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對殼聚糖的抑菌機制的認識有了長足的進步；殼聚糖抑菌機制：（1）干擾菌體細胞膜功能，這種機制主要對革蘭氏陽性菌起主導(dǎo)作用。（2）還可以直接與菌體DNA和mRNA作用。Liu等[2]在測試殼聚糖的抑菌能力的實驗中，用FITC（異硫氰酸熒光素）來標記低分子質(zhì)量的殼聚糖，并與大腸桿菌一起培養(yǎng)；結(jié)果經(jīng)過熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌的胞體內(nèi)存在大量被標記的分子質(zhì)量為8000 u和4000 u的殼聚糖。推測可能是由于低分子質(zhì)量的殼聚糖可以通過滲透的方式進入到細菌的胞體內(nèi)，帶正電荷的殼聚糖與帶負電荷的DNA相互作用，影響RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，達到抑菌的目的。（3）激活幾丁質(zhì)酶，殼聚糖作為幾丁質(zhì)酶的底物，在其大量存在的條件下，病原真菌的幾丁質(zhì)酶的活性可以被激發(fā)出來。對于大多數(shù)病原真菌來講，當殼聚糖濃度很高時，病原真菌體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶就被過分的表達，從而降解其自身細胞壁的幾丁質(zhì)，導(dǎo)致細胞壁損壞，發(fā)揮抑菌效果[3]。（4）通過氨基起抑菌作用，王鴻等[4]在不同脫乙酰度的殼聚糖的抑菌研究中，認為殼聚糖的抑菌作用可能是通過其帶正電荷的氨基與細菌的細胞壁結(jié)合，阻礙細菌增殖來實現(xiàn)的。革蘭氏陰性菌的細胞壁的最外層是一層較厚的類脂多糖，有吸附陽離子的作用；當其吸附了質(zhì)子化的殼聚糖后，與Ca2+結(jié)合的機會就減少，脂多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性變差，內(nèi)壁層肽聚糖暴露出來容易被溶菌酶水解。

本研究通過肉湯稀釋法測定低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對大腸埃希菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對白色念珠菌的最小抑菌濃度都為0.5 mg/mL。大大的提高了原有殼聚糖的抑菌能力，比單純無降解的大分子殼聚糖的最小抑菌濃度大大降低，說明低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物對細菌和真菌都有很強的抑制能力，具有廣譜的抗菌能力，同時低分子量殼聚糖酸降解產(chǎn)物的水溶性和脂溶性都能大大提高殼聚糖的應(yīng)用。這是因為分子質(zhì)量是影響殼聚糖抑菌作用的重要因素，許瑩等[5]發(fā)現(xiàn)低分子量殼聚糖（分子質(zhì)量為1.7 ku）抗菌效果最明顯，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率有顯著增加。低分子量殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌活性也隨分子質(zhì)量的降低而升高[2]。鄭連英等[6]也得出同樣的結(jié)論，指出分子質(zhì)量小于5 ku時，殼聚糖抗菌性最強。殼聚糖抑菌活性與pH值成反比關(guān)系。pH值升高，殼聚糖的溶解性和質(zhì)子化程度降低，抗菌性逐漸降低。反之，殼聚糖分子所帶正電荷增加，使其抑菌活性增加。在pH酸性溶液中，殼聚糖成為陽離子型生物絮凝劑，導(dǎo)致菌體新陳代謝紊亂，起到殺菌、抑菌作用。當pH值小于6時，殼聚糖具有顯著的抑菌效果。而在中性及堿性條件下殼聚糖溶解性較差，不具有殺菌能力[7]。No等[8]系統(tǒng)研究了不同pH值對殼聚糖抗菌活性的影響，得出殼聚糖的抑菌活性在pH值為3時達到最高值，隨著pH值的升高而逐漸降低。pH值大小對不同真菌的敏感性也存在差異?？傊?，pH值在酸性范圍時有助于激發(fā)殼聚糖的抗菌性。而低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物因為有磷酸化降解過程，制備的產(chǎn)物具有水溶性和脂溶性而且水溶后pH值可達到4.0，所以大大的提高了殼聚糖的抑菌能力，與文獻[9]報道相符。

低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物醫(yī)用栓劑敷料和醫(yī)用水凝膠敷料對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及白色念珠菌的抑菌環(huán)直徑分別為13、13、11 mm和14、14、12 mm。說明低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物衍生醫(yī)用栓劑敷料和醫(yī)用水凝膠敷料都對細菌及真菌具有明顯的抑制作用，具有廣譜抗菌作用。制備婦科醫(yī)用敷料在臨床有廣泛的應(yīng)用前景。由于陰道和宮頸口生理結(jié)構(gòu)的特殊性，面對婦科常見的生殖道感染，使用抗菌藥物和外用清洗液常不能獲得立即的效果[10]；同時，抗菌藥物過多過頻使用常導(dǎo)致耐藥菌的增多，部分抗菌藥物藥效下降；過多的清洗陰道，常導(dǎo)致陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)，條件致病菌過渡增殖導(dǎo)致感染[11]。具有抑菌活性的低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物制作婦科醫(yī)用敷料的應(yīng)用將有效解決這一問題，陰道的酸性環(huán)境（pH 3.8~4.4）也為其抑菌活性的發(fā)揮提供了最佳環(huán)境[12]。本研究將自然界廣泛來源的甲殼素，即高乙酰化的殼聚糖經(jīng)磷酸法降解的產(chǎn)物與聚乙二醇、明膠等其他成分制成不同形式的婦科醫(yī)用敷料，并觀察不同敷料的抑菌效果，旨在為慢性宮頸炎、BV和VVC等生殖道感染性疾病的治療提供參考，這對減少抗菌藥物的使用，減少細菌、真菌耐藥的產(chǎn)生具有積極意義[13]。殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物敷料的應(yīng)用將有效減少宮頸癌術(shù)后切口和宮頸癌放療過程中感染的發(fā)生，促進手術(shù)切口或潰瘍口的愈合，為女性生殖道感染的治療提供了新思路[14]。

總之殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物具有強大的廣譜抗菌性能，以低分子量殼聚糖磷酸降解產(chǎn)物制作婦科醫(yī)用敷料具有巨大的市場及經(jīng)濟效益，值得大力推廣應(yīng)用。

[1]梁成軍.殼聚糖/棉針織敷料的研究[D].西安：西安工程科技學(xué)院，2006.

[2] Liu X F，Guan Y L，Li D Z，et al.Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan[J].Journal of Applied Polymer Science，2001，79（7）：1324-1335.

[3]黎軍英，李紅葉.殼聚糖對桃褐腐病菌的抑菌作用[J].電子顯微學(xué)報，2002，21（2）：138-140.

[4]王鴻，沈月新.不同脫乙酰度殼聚糖的抑菌性[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2001，10（4）：380-382.

[5]許瑩，陳建勇.殼聚糖與纖維素的結(jié)合及其抗菌性能的研究[J].浙江印染信息與技術(shù)，2002，28（2）：1-3.

[6]鄭連英，朱江峰，孫昆山.殼聚糖的抗菌性能研究[J].材料工程與科學(xué)，2000，18（2）：22-24.

[7]馮小強，李小芳，楊聲，等.殼聚糖抑茵性能影響因素、機理及其應(yīng)用研究進展[J].中國釀造，2009，202（1）：19-23.

[8] No H K，Park N，Lee S H，et al.Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights[J].International Journal of Food Micmbiology，2002，74（1-2）：65-72.

[9]李蘭英，劉曉麗，徐云飛，等.殼聚糖液晶膜生物相容性的研究[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，2008，5（27）：755-759.

[10]柳金香.細菌性陰道炎的臨床治療分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（31）：106-107.

[11]劉碧源，高仕英.殼聚糖及其衍生物的抗微生物活性研究進展[J].中國生化藥物雜志，2003，12（4）：268-270.

[12] Liu N，Chen X G，Park H J，et al.Effect of MW and concentration of chitosan on antibacterial activity of eseherichia coli[J].Carbohydrate Polymers，2006，64（8）：60-65.

[13]嚴欽，沈月新，王造.殼聚糖的制備及其抑菌性能研究[J].食品研究與開發(fā)，2003，24（2）：26-27.

[14]李蘭英.添加殼聚糖的藻酸鹽印模材料抗菌性能研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（30）：144-146.