谷見法 王曉敏 路平

中藥砒霜的有效成份即為三氧化二砷（As2O3），可使急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床緩解率達(dá)到80%以上[1-2]。許多研究證實(shí)，As2O3對(duì)多種實(shí)體瘤如肝癌[3]、乳腺癌細(xì)胞[4-5]、胃癌[6]、骨髓瘤[7]、淋巴瘤[8]、腎母細(xì)胞瘤[9]等都有明顯的增殖抑制作用。但在食管癌[10]方面，相關(guān)研究報(bào)道較少見。而食管癌是我國(guó)常見腫瘤[11]。本研究探討食管癌EC-1細(xì)胞在三氧化二砷作用的變化，并尋找其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞株EC-1細(xì)胞。

1.1.2 主要儀器 MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo electron公司）恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（英國(guó)RSBionch公司）；Epic XL II型里流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），倒置顯微鏡（EE 2000-U）（日本Nikon公司），OLYMPUS直立光照照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EC-1細(xì)胞增殖反應(yīng)檢測(cè) 采用MTT法，實(shí)驗(yàn)根據(jù)三氧化二砷濃度分八組：64、32、、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。以每孔6×l03個(gè)細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后，加入用上述不同最終濃度的As2O3，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。觀察24、48、72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT液20 uL，繼續(xù)孵育4 h，棄內(nèi)液。每孔再加入二甲亞礬，放在震蕩混合儀上常溫震蕩10 min。在酶標(biāo)儀讀取492 nm的吸光度（OD），計(jì)算抑制率。實(shí)驗(yàn)取3個(gè)平行孔，重復(fù)3次，取平均值。抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡 取在指數(shù)生長(zhǎng)期的EC-1細(xì)胞，把細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL接種6孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種后24 h后，實(shí)驗(yàn)組加三氧化二砷處理。48 h培養(yǎng)后，消化離心成單細(xì)胞懸液，冷PBS洗滌兩次。PBS打散制成細(xì)胞懸液，加進(jìn)5 μL RNA酶（10 mg/mL），放在37 ℃水中1 h。加入50 μL碘化丙啶，30 min避光染色，400目篩網(wǎng)濾過后，樣品在流式細(xì)胞儀在488 nm處檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)As2O3對(duì)EC-l的增殖抑制作用 MTT法檢測(cè)不同濃度（64、32、16、8、4、2、l、0.5 μmol/L）的As2O3對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞作用24、48、72 h后的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：隨濃度升高，抑制作用增強(qiáng)，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)，即存在量效和時(shí)效關(guān)系。圖1可見，抑制率與As2O3濃度表現(xiàn)出梯度變化的曲線關(guān)系，并求出As2O3作用食管癌EC-1細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制率（IC50）為18.74 μmol/L。圖中也可見細(xì)胞抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度大致為19 μmol/L。

圖1 三氧化二砷對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞的抑制作用

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡 為探討As2O3對(duì)人食管癌EC-1細(xì)胞作用機(jī)制，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡改變及細(xì)胞周期分布的變化。表1可見As2O3可使細(xì)胞阻滯在G2/M期，使G0/G1期、S期細(xì)胞比例減少，增加細(xì)胞凋亡。

表1 不同處理組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（x-±s）

3 討論

中藥砒霜的主要組分即為As2O3，其用于治療疾病已有源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的歷史，但其毒性大，限制了在臨床上的廣泛使用。在上世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)學(xué)者應(yīng)用主要成分為As2O3的癌靈1號(hào)在急性早幼粒細(xì)胞白血病療效顯著。隨后更多的學(xué)者開始進(jìn)行實(shí)體瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，在食管癌方面，景紹武[12]發(fā)現(xiàn)As2O3能增加放療對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109增殖的抑制作用。

筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MTT法檢測(cè)了不同濃度對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞的增值抑制的結(jié)果顯示：As2O3對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞具有抑制增殖作用，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，劑量增加而抑制作用更明顯，即呈時(shí)效和劑效關(guān)系，與景紹武[12]用As2O3作用于食管癌細(xì)胞株Eca109的研究結(jié)果符合。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡，結(jié)果表明 As2O3主要使細(xì)胞周期在G2/M期阻滯，G0/G1期細(xì)胞減少，與Ling等[13]同在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞系，李嵐[14]在胃癌BGC-823細(xì)胞研究結(jié)果符合。但也有研究報(bào)告As2O3在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，細(xì)胞在G2/M期及G1期阻滯[15]，這可能與不同細(xì)胞系有關(guān)。綜上所述，As2O3對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞有抑制作用，為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供依據(jù)。

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