趙騰 陳海龍 劉晶瑤 孫莉 周春奎

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）指的是出血性、缺血性以及急性和慢性缺血缺氧性腦血管疾病所導(dǎo)致的腦組織損傷進(jìn)而誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙的一種臨床綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1-2]。研究探討其發(fā)病機(jī)制并在此基礎(chǔ)上有針對(duì)性地進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)對(duì)于預(yù)防血管性癡呆具有非常重要的意義。有研究顯示白質(zhì)脫髓鞘是VD的發(fā)病機(jī)制之一，而神經(jīng)束蛋白155（Neurofascin155，NF155）在保持髓鞘的穩(wěn)定中起到了關(guān)鍵的作用，NF155缺失會(huì)造成軸突-膠質(zhì)間隔樣連接消失，從而降低神經(jīng)傳導(dǎo)的速度[4-6]。本研究通過對(duì)慢性缺血致血管性癡呆大鼠腦內(nèi)NF155的水平進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步明確慢性缺血是否通過影響NF155，進(jìn)而破壞髓鞘的穩(wěn)定性，從而出現(xiàn)血管性癡呆。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2013年12月-2014年5月期間選擇清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只，大鼠的質(zhì)量為250~300 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（吉）2012-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK （吉）2012-0012，實(shí)驗(yàn)在吉林大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，檢測(cè)期間統(tǒng)計(jì)40只大鼠在6 d里的訓(xùn)練成績(jī)，其總平均潛伏期為（30.85±9.45）s，期間死亡1只，另有3只大鼠不符合標(biāo)準(zhǔn)。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組12只，模型組24只（30 d組12只，60 d組12只）。大鼠稱重，按10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，采用2VO法復(fù)制慢性前腦缺血致血管性癡呆的動(dòng)物模型。假手術(shù)對(duì)照組除不結(jié)扎、不剪斷頸總動(dòng)脈，其余過程與模型組相同。造模后第5天開始水迷宮試驗(yàn)，5次/d，2 min次/，共5 d。測(cè)試第3天，開始記錄成績(jī)，如測(cè)試第5天，逃避潛伏期仍超過20 s或2次誤入其他盲端即為血管性癡呆模型。術(shù)后30 d和60 d將模型組大鼠和相應(yīng)對(duì)照組大鼠用10%水合氯醛麻醉。然后在冰盤上快速斷頭取腦，將出腦組織置于玻璃勻漿器中研磨，2000 r/min離心15 min，取上清，無菌過濾后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NF155的檢測(cè)方法 標(biāo)準(zhǔn)品按以下濃度稀釋：3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24 ng/mL、48 ng/mL。（NF155抗體，產(chǎn)地：中國上海，規(guī)格：1.0 g），分別設(shè)定樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔。將稀釋后的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入準(zhǔn)品孔中，樣本孔內(nèi)先加入10 μL待測(cè)樣本，然后用稀釋液稀釋5倍，空白孔不加。各樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品中每孔均加入100 μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封板膜密封，37 ℃水浴60 min。棄去液體后拍干，加洗滌液300 μL/孔，靜置1 min后拍干，如此重復(fù)5 次，然后拍干。分別加入底物A和底物B 50 μL/孔，37 ℃避光孵育15 min。取出酶標(biāo)板，加終止液終止反應(yīng)50 μL/孔。以空白孔調(diào)零，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值（OD值）。終止后15 min內(nèi)檢測(cè)完成，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線所對(duì)應(yīng)的公式計(jì)算出NF155的濃度值即可。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，各組間樣本均數(shù)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的Morris水迷宮結(jié)果比較 造模前水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠逃避潛伏期與假手術(shù)對(duì)照組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后30 d組第6天開始，大鼠逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后60 d組第5天開始，逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1~2。

表1 造模前水迷宮結(jié)果比較（x-±s） s

表2 造模后水迷宮比較（x-±s） s

2.2 各組的NF155檢測(cè)結(jié)果比較 經(jīng)檢測(cè)，假手術(shù)對(duì)照組的NF155濃度為（85.07±6.75）ng/mL，術(shù)后30 d組的NF155濃度為（48.27±7.32）ng/mL，術(shù)后60 d組的NF155濃度為（37.65±6.88）ng/mL，比較分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后30 d組和術(shù)后60 d組的NF155濃度均明顯低于假手術(shù)對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.803、7.043，P=0.000、0.000）；而術(shù)后30 d組NF155濃度又明顯高于術(shù)后60 d組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.662，P=0.001）。

3 討論

血管性癡呆的發(fā)病原因主要是由缺血性、缺氧性、出血性腦血管病等導(dǎo)致腦組織損害引起的，其主要臨床特征是認(rèn)知功能障礙，臨床上患者通常表現(xiàn)為認(rèn)知能力減退、學(xué)習(xí)能力和記憶功能衰退以及行為障礙等[7]。隨著我國人口老齡化程度加深，腦血管病發(fā)病率以及血管性癡呆的發(fā)病率逐漸上升。臨床流行病學(xué)研究資料顯示，我國血管性癡呆的發(fā)病率明顯高于阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），不僅嚴(yán)重危害老年人生活質(zhì)量，同時(shí)也給患者的家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[8]。國外研究顯示VD是防治癡呆的主要突破口，因此探討其發(fā)病機(jī)制同時(shí)尋求切實(shí)有效的治療方法是解決這一問題的關(guān)鍵[9]。

前期病理研究表明，當(dāng)慢性腦缺血大鼠額、顳葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞以缺血性改變?yōu)橹鲿r(shí)，腦白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)纖維斷裂及髓鞘脫失的改變，證明全腦缺血的大鼠腦白質(zhì)損傷也是重要的病理改變之一[10-12]。因此本課題專注于研究慢性腦缺血所致血管性癡呆大鼠白質(zhì)相關(guān)的改變。

神經(jīng)束蛋白（Neurofascin，NF）是由腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞表面蛋白，根據(jù)分子量不同可分為NF-l86和NF-155。其中，NF-155屬于免疫球蛋白家族中L1亞群中的細(xì)胞黏附分子，分子量155kD[13]。國內(nèi)外研究表明，NF155在髓鞘的穩(wěn)定中具有重要的作用[14]。因此，其在腦白質(zhì)損傷（Cerebral white matter lesion，CWML）性疾病中的作用受到了研究者越來越多的重視。然而，目前對(duì)NF155的研究主要集中于多發(fā)性硬化及急性缺血性腦損傷，對(duì)于NF155與蛋白質(zhì)疾病關(guān)系之類的報(bào)道極少，NF155與慢性腦缺血致血管性癡呆的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道[15]。然而，結(jié)合慢性缺血后腦白質(zhì)損傷的病理學(xué)改變，推測(cè)在維持髓鞘的結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用的NF155在慢性缺血腦組織中的含量肯定發(fā)生了實(shí)質(zhì)性變化，因而選擇NF155作為研究血管性癡呆的相關(guān)性因子是可行的。通過本研究結(jié)果證實(shí)，術(shù)后30 d組和術(shù)后60 d組的大鼠的逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)對(duì)照組，且慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠腦內(nèi)NF155的含量較假手術(shù)對(duì)照組明顯降低，數(shù)據(jù)顯示隨著大鼠癡呆程度加深，NF155的表達(dá)量逐漸減少，表明VD大鼠認(rèn)知功能、記憶功能減退可能與NF155的減少有關(guān)，表明NF155的減少與血管性癡呆的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，推測(cè)NF155參與了血管性癡呆的形成過程。

本結(jié)論為血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步通過對(duì)NF155進(jìn)行干預(yù)從而預(yù)防血管性癡呆的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

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