高麗霞 馬國強

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種具有氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)的多發(fā)性呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。既往研究表明，炎癥細胞發(fā)生趨化、激活及大量炎癥因子的釋放是COPD氣道炎癥的中心環(huán)節(jié)[3-4]。NF-κB是一類普遍存在的、控制著多種基因轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于一個由復(fù)雜多肽亞單位組成的蛋白家族[5]。當細胞受到病原微生物、有害煙霧、粉塵、細胞因子、活性氧等刺激時，COPD患者肺中產(chǎn)生多種炎癥細胞因子，如白介素-1、白介素-6等，而這些炎癥因子又是NF-κB的較強激活劑，這就構(gòu)成了炎癥細胞-細胞因子之間的反應(yīng)呈現(xiàn)級源式放大，促使炎癥長期化存在[6]。TNF-α是一種重要的內(nèi)源性細胞因子，具有多種前炎癥介質(zhì)的功能，可促進中性粒細胞脫顆粒伴蛋白水解酶釋放和呼吸爆發(fā)等，同時令氣道上皮細胞、巨噬細胞和肺組織的NF-κB活性增強[7]。

目前大多研究主要集中于COPD急性加重期多種炎性因子與疾病嚴重程度及預(yù)后的關(guān)系的探討，對穩(wěn)定期患者的炎癥反應(yīng)情況研究較少。而本研究將在穩(wěn)定期COPD患者中，采用ELISA法測定血清TNF-α及NF-κB水平變化情況，同時展開兩者變化與一般臨床資料間相關(guān)性分析，以期揭示TNF-α及NF-κB在穩(wěn)定期COPD患者發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月-2014年12月本院病理科診斷為COPD的108例患者及同期體檢中心健康體檢者95例為研究對象。入選標準以《慢性阻塞性肺疾病指南》診斷標準為診斷依據(jù)：（1）給予支氣管舒張藥治療后，相關(guān)指標（FEV1.0<80%，F(xiàn)EV1.0/FVC<70%）達到診斷標準。（2）穩(wěn)定期的判定：3個月之內(nèi)患者無急性加重，出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽和咳痰等癥狀[8]。排除標準：近期口服糖皮質(zhì)激素等藥物，急性感染，肝、腎功能不全，心肌梗死，自身免疫性疾病，惡性腫瘤及其他代謝疾病如糖尿病、甲亢等，近期手術(shù)的患者排除在外。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而COPD組患者的體重指數(shù)（BMI）較對照組偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 ELISA方法測定血清TNF-α及NF-κB水平：研究對象均于清晨空腹靜脈采血3 mL，EDTA促凝管收集血液，離心（3000 rpm，15 min），吸取上清，-20 ℃保存待測。待測時，室溫解凍，嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書進行操作。簡要步驟如下：首先利用已知抗原包被固相載體，加入待檢標本，經(jīng)過37 ℃溫育2 h，使相應(yīng)抗體與固相抗原充分結(jié)合；洗滌，除去與反應(yīng)無關(guān)的物質(zhì)；加入酶標抗抗體，再次37 ℃溫育2 h后與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體；加底物顯色15 min。終止反應(yīng)后，用酶標儀測光密度值定量測定。

ELISA檢測的原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進行處理及分析，計量資料用（±s）表示，采用兩樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TNF-α、NF-κB水平比較 與對照組比較，COPD患者TNF-α、NF-κB水平均升高，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.516，P<0.05），見表2。

表2 兩組TNF-α、NF-κB水平比較（x-±s）pg/mL

2.2 COPD穩(wěn)定期患者NF-κB水平與血清TNF-α水平變化的相關(guān)性分析 通過直線相關(guān)性分析得出，COPD穩(wěn)定期患者NF-κB和TNF-α水平存在正相關(guān)趨勢（P<0.05）。

3 討論

COPD不僅出現(xiàn)肺部的慢性炎癥反應(yīng)，而且還可導(dǎo)致輕度的全身炎癥反應(yīng)。但目前對于COPD導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的結(jié)論尚無統(tǒng)一定論。多數(shù)學(xué)者認為炎癥級聯(lián)反應(yīng)中部分炎癥細胞和/或炎癥介質(zhì)，如中性粒細胞及巨噬細胞、單個核細胞增多、淋巴細胞中細胞色素氧化酶活性增加，以及炎癥因子IL-6、IL-8及CRP等增高。其中，大多數(shù)炎癥細胞和炎癥介質(zhì)通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，細胞與細胞、介質(zhì)與介質(zhì)、細胞與介質(zhì)互相影響、激活。細胞與介質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞可以引起系統(tǒng)的慢性炎癥病理改變。目前，對于COPD診斷和治療手段有限，且COPD在發(fā)病初期的癥狀是緩慢變化的，大多數(shù)患者只有在COPD急性期才進行住院治療，這導(dǎo)致其致死率逐年上升。既往研究表明，COPD發(fā)病過程中，呼吸氣道以及肺實質(zhì)、肺血管等部位以慢性炎癥為典型特征，同時涉及自助神經(jīng)功能紊亂，如膽堿能神經(jīng)受體失活且分布異常，氧化及抗氧化機制失調(diào)，蛋白酶及抗蛋白酶失衡等機制。其中，大多數(shù)學(xué)者認為COPD發(fā)生時呼吸氣道炎癥的關(guān)鍵在于炎癥細胞的激活以及大量炎癥因子的釋放，如中性粒細胞（PMN）、肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞（尤其是CD8+）為主的炎癥細胞。這些釋放的大量炎癥細胞因子和炎癥介質(zhì)、炎癥細胞相互作用，共同刺激COPD進程[9]。本研究通過對COPD患者外周血炎癥因子水平NF-κB與TNF-α的測定，闡明其在COPD發(fā)病過程中的作用，為COPD早起實施有效的診斷、治療措施及強化穩(wěn)定期的治療提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，兩組年齡、性別分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩者具有可比性。而COPD組體重指數(shù)（BMI）較對照組偏低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明穩(wěn)定期COPD患者普遍存在營養(yǎng)不良、體質(zhì)量下降的現(xiàn)象，可能是由于COPD患者存在熱能攝入不足、呼吸做功增加導(dǎo)致能量消耗增加、分解代謝亢進等原因引起，為此筆者建議臨床醫(yī)師在臨床治療實踐中，及時給予COPD患者營養(yǎng)支持治療。

同時，COPD組與對照組血清TNF-α、NF-κB水平相比較，COPD組TNF-α、NF-κB水平均升高，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明慢阻肺氣道肺部及全身炎癥過程中，NF-κB的激活與TNF-α炎癥因子相互作用起了重要作用。NF-κB是從小鼠B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，是普遍存在于細胞質(zhì)中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與免疫反應(yīng)及細胞增殖、分化等過程[10-11]。激活NF-κB已成為肺部炎癥性疾病的一個重要特征，這與國內(nèi)外研究一致[12]。TNF-α是一種來源于巨噬細胞和單核細胞的細胞因子。既往研究表明，一定濃度的TNF-α因子表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗感染、抗病毒的活性，而過量的TNF-α因子，則積極參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致周圍組織細胞損害，加速COPD的進程。另外，正常水平的TNF-α可以引起腫瘤細胞凋亡、提高中性粒細胞的吞噬能力等，但TNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷[13-14]。

本研究關(guān)于NF-κB與TNF-α直線相關(guān)分析的結(jié)果還表明，COPD穩(wěn)定期患者NF-κB和TNF-α水平存在正相關(guān)趨勢，可能機制為NF-κB介導(dǎo)多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，而TNF-α則又成為NF-κB的激活劑，從而形成了NF-κB與炎癥因子間的正反饋效應(yīng)。他們互相促進，加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的重塑和氣流阻塞，嚴重影響肺臟功能[15-18]。

綜上所述，穩(wěn)定期COPD患者存在炎癥反應(yīng)因子NF-κB、TNF-α水平異常變化，這些因素促進COPD患者的病情不斷惡化進展。因此對于COPD患者的治療不僅在發(fā)作期，即使在穩(wěn)定期也應(yīng)予持續(xù)干預(yù)，以降低COPD急性發(fā)作率及致死率，提高患者生活質(zhì)量，改善預(yù)后。

[1]吳海洪，高芳蝶，詹潔堅，等.噻托溴銨聯(lián)合沙美特羅/氟替卡松治療慢性阻塞性肺疾病的臨床研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（6）：412-414.

[2]薛華.穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者CRP、D-D水平與肺動脈高壓的關(guān)系[J].臨床肺科雜志，2015，20（6）：1117-1119.

[3]王海峰，李建生.慢性阻塞性肺疾病急性加重期相關(guān)炎癥標記物研究進展[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33（8）：1972-1974.

[4]老啟芳，曾小良，鐘小寧，等.肺功能正常吸煙者和慢性阻塞性肺疾病患者肺動脈炎癥和小氣道炎癥的相關(guān)性研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（12）：903-908.

[5]崔雯雯，金鑫，王宏濤，等.NF-κB信號通路與肺部炎癥疾病[J].中國急救醫(yī)學(xué)，2015，（3）：283-287.

[6]高蔚，翁婷，孟文書，等.慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰中β-防御素2水平及其與NF-κB的相關(guān)性[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（24）：4401-4403.

[7]虞玉英，胡克崇，徐慧芳，等.布地奈德聯(lián)合孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病患者肺功能及血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響[J].中國生化藥物雜志，2014，29（7）：153-155.

[8]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（4）：255-264.

[9]黃平富，王勝，趙志奮.冬病夏治敷貼聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療對COPD穩(wěn)定期患者30例的療效觀察[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2014，12（32）：64-66.

[10]羅紅燦，和紅兵.核因子-κB對慢性炎性骨病作用的研究進展[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（30）：161-163.

[11]夏寧，鄧健.核轉(zhuǎn)錄因子和細胞間黏附分子在口腔癌細胞中的表達及臨床意義[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（10）：136.

[12] John W，Christman，Sadikot，et al.The role of nuclear factor-κB in pulmonary diseases[J].Chest，2000，117（5）：1482-1487.

[13]張念，徐清，陳菁，等.吸煙對慢性阻塞性肺疾病患者血清及肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α及干擾素-γ的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（12）：1980-1982.

[14]吳水淼，王妨娥，凌敏，等.TNF-α基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系[J].西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，35（6）：820-823.

[15]張文斌，朱成均，石泉，等.前列腺素E1降低心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌細胞NF-κB活性及血漿TNF-α水平[J].重慶醫(yī)學(xué)，2015，（16）：2183-2185，2188.

[16]顧星，姚敏，王司曄，等.腫瘤壞死因子α/核因子-κB信號通路活化干預(yù)對肝癌細胞增殖的抑制作用[J].中華肝臟病雜志，2014，22（6）：434-439.

[17]李翔.癌性胸液中4種標志物水平的檢測及臨床意義[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2014，12（24）：43-44.

[18]熊永平.支原體肺炎患兒血清IL-2、IL-8、TNF-α表達情況分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（22）：78-79.