王曉晨 , 李 勇 , 張 靜 , 趙寧寧 , 秦巍侖,秦桂祥 , 高婷婷

(1.中國科學院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2.中國科學院大學, 北京100049; 3.中國科學院 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 4.江蘇中洋集團有限公司, 江蘇 南通226600; 5.海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術國家地方聯合工程實驗室, 山東 青島266071)

暗紋東方 鲀 (Takifugu obscures), 俗稱氣泡魚, 隸屬于 鲀 形目(Tetraodontiformes)、鲀科(Tetraodontidae)、東方 鲀 屬(Fugu), 分布于日本、朝鮮以及中國渤海、黃海、東海等海域, 屬近海暖溫水性底棲魚類[1]。與鰣魚(Tenualosa reevesii)、刀魚(Coilia ectenesJordan)同為江海洄游性魚類, 因過度捕撈、水環(huán)境惡化, 數量急劇減少, 已成為海江珍稀魚類之一[2]。

目前, 東方鲀屬(Fugu)魚類已實現設施無毒化養(yǎng)殖, 但其營養(yǎng)飼料研究滯后, 如何研發(fā)出高效、低污染、低成本(一高二低型)專用配合飼料, 成為制約產業(yè)可持續(xù)發(fā)展、實現健康高效養(yǎng)殖的技術瓶頸。東方 鲀 屬 魚 類營養(yǎng)需求研究多見于紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)[3-11], 暗 紋東方 鲀 僅見蛋白質和淀粉需求[12-13]。探求適宜營養(yǎng)素及營養(yǎng)源組合、獲得暗紋東方 鲀 一高二低型專用配合飼料等研究尚屬空白。

本研究在設施養(yǎng)殖條件下, 以現代動物營養(yǎng)學強調的組合效應、營養(yǎng)結構和系統(tǒng)調控等新理念為指導, 采用新穎的生態(tài)營養(yǎng)學原理和方法, 通過將兩種營養(yǎng)素蛋白質和脂肪的不同水平與蛋白營養(yǎng)源魚粉不同水平進行組配, 探 尋對暗紋東方 鲀 生長、消化吸收和水環(huán)境的影響, 初步確定主要營養(yǎng)素源的適宜組合水平, 為 開發(fā)暗紋東方 鲀 生態(tài)專用配合飼料提供理論和應用依據, 對珍稀魚類優(yōu)良遺傳潛力發(fā)揮和規(guī)?；】叼B(yǎng)殖具有重要價值和意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和分組

試驗采用3×2×2三因素設計(表1), 2個營養(yǎng)素因素:蛋白質水平為43%、40%、37%分別表示為P43、P40、P37; 脂肪水平為10%、7%, 分別表示為L10、L7), 1個營養(yǎng)源因素: 魚粉水平為高(49%～55%)、低(39%～ 45%),分別表示為 FH、FL。共 12個不同組合處理組:1#(P43L10FH)、 2#(P43L7FH)、 3#(P40L10FH)、4#(P40L7FH)、5#(P37L10FH)、6#(P37L7FH)、7#(P43L10FL)、8#(P43L7FL)、9#(P40L10FL)、10#(P40L7FL)、11#(P37L10FL)、12#(P37L7FL), 每處理3重復。

1.2 試驗飼料

12種試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。 在江蘇中洋集團河豚莊園營養(yǎng)中心飼料車間, 按照配方組成和比例, 將飼料原料進行一次混合, 超微粉碎, 再經二次混合, 制成粉狀全價配合飼料, 包裝備用。為適應設施養(yǎng)殖 暗 紋東方 鲀 的特殊采食習性, 飼喂前將粉狀料、水以1.25/1的重量比例混合, 拌成黏性團狀飼料, 進行投喂。

表1 試驗處理與飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質)Tab.1 Treatments, composition, and nutrient levels of the experimental diet (DM)

1.3 試驗用魚和飼養(yǎng)管理

試驗在江蘇中洋集團河豚莊園養(yǎng)殖溫室進行,試驗魚由河豚莊園提供。正式試驗前, 將同一養(yǎng)殖溫室同源同批 暗 紋東方 鲀 在試驗條件下喂食同一種商品飼料, 使之逐漸適應環(huán)境和配合飼料。馴養(yǎng) 25 d后, 禁食 24 h, 挑選健康無病、規(guī)格整齊(172.87g±6.71g)的試驗魚1 080尾, 隨機分到 36個圓形桶(直徑1.5 m、水深0.6 m)中, 每桶30尾。

試驗養(yǎng)殖密度為 4.89 kg/m3, 水溫為 22～26℃,鹽度為8～12, DO≥5.0 mg/L, pH為8.06～8.46。養(yǎng)殖期為77 d。試驗期間, 每天7: 30、16: 00投喂, 將飼糧放食臺上, 放入養(yǎng)殖桶, 半小時后取出食臺, 將殘餌風干稱質量, 以剩少許殘餌視為飽食。每天換水1/3, 添加一定比例的海水和淡水, 保持水體的穩(wěn)定鹽度。每天記錄投喂量、殘餌量, 根據攝食情況及時調整投喂量。發(fā)現死魚及時撈出并稱質量記錄。

1.4 樣品采集和指標測定

1.4.1 樣品采集

試驗結束后, 禁食24 h, 稱質量。 每桶隨機選取6尾中等體質量的試魚, 用20～30 mg/L的MS-222做快速深度麻醉, 冰盤中解剖剝離腸和肝胰臟, 迅速將樣品分裝入封口袋, -20℃保存待測。取飼糧樣品用四分法縮減至 200 g, 分裝入封口袋, 進行營養(yǎng)成分分析。

1.4.2 飼糧營養(yǎng)成分

干物質采用失重法, 105℃烘箱干燥至恒質量;粗蛋白采用凱氏定氮法; 粗脂肪采用油重法, 即石油醚為浸提溶劑, 利用索氏抽提法抽提脂肪; 粗灰分采用焚燒法, 即樣品炭化至無煙, 移至馬福爐 550℃焚燒至恒重; 鈣采用高錳酸鉀法; 總磷采用鉬黃比色法。

1.4.3 生長指標

存活率(%)=(終末尾數/初始尾數)×100; 日增質量(g/尾/日)=(終末均質量-初始均質量)/試驗天數;增質量率(%)=[(終末體質量-初始體質量)/初始體質量]×100; 飼料系數=(總投喂量-總殘餌量)/(終末體質量-初始體質量)。

1.4.4 消化吸收酶活力

使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒,按說明書測定暗紋東方 鲀 腸中(胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、堿性磷酸酶、Na+-K+-ATP酶)和肝胰臟中(脂肪酶、淀粉酶)的活性。測定前首先樣品預處理, 加入生理鹽水制備組織勻漿, 2 500 r/min離心10 min,通過預試驗確定稀釋倍數后, 進行正式指標測定。酶活性用比活力( U/mg蛋白或U/g蛋白) 表示。

1.4.5 水環(huán)境指標

試驗結束前一周, 早上7: 30投喂結束, 將殘餌稱質量后, 換水2/3。次日 7: 30投喂前, 依次從 36個桶中取水樣100 mL, 進行水環(huán)境指標測定。氨氮和亞硝酸氮在2 h內完成測定; 磷酸鹽和COD在48 h內完成測定。氨氮采用納氏試劑比色法; 亞硝酸氮采用鹽酸萘乙二胺法; COD采用重鉻酸鉀法; 磷酸鹽采用總磷總氮聯合消化法。

1.5 數據分析

試驗數據用 SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計, 采用 3因素方差分析和Duncan檢驗法統(tǒng)計分析。結果均用“平均值±標準差(Mean ± SE)”表示。

2 結果與分析

2.1 生長性能

12種營養(yǎng)素源組合飼糧下, 暗 紋東方 鲀 的生長性能結果見表2。

2.1.1 存活率、末質量、日增質量

生長結果(表2)表明: 各組存活率基本在90%以上, 且差異不顯著(P＞0.05)。蛋白質、脂肪單因素均對日增質量有顯著或極顯著影響(P＜0.05或0.01)。雙因素蛋白質和脂肪、魚粉分別互作對日增質量有顯著或極顯著影響。3因素互作對日增質量有極顯著影響(P＜0.01)。單因素和因素互作對末質量的顯著性影響與日增質量具有相似特征。

2.1.2 增質量率

表2中增質量率結果表明, 單因素脂肪、魚粉均影響極顯著(P＜0.01), 蛋白質影響不顯著(P＞0.05);雙因素蛋白質和魚粉互作有顯著影響。值得注意的是, P40和FH、FL分別互作, 效應均與P43FH差異不顯著(圖1)。3因素互作有顯著影響(P＜0.05), 最高的1#、9#分別較8#提高79.98%、54.32%; 低魚粉組11#與高魚粉組4#、5#均無顯著差異。

圖1 蛋白質和魚粉互作對增質量率的效應Fig.1 Effects of protein and fish meal interactions on WGR

2.1.3 飼料系數

表2中飼料系數結果表明, 單因素蛋白質、脂肪均有極顯著影響(P＜0.01)。雙因素蛋白質和脂肪、魚粉分別互作均差異極顯著(P＜0.01)。值得注意的是,P43L10和 P40L10, P43FH和P40FL分別差異不顯著(圖2, 圖3)。3因素互作差異顯著(P＜0.05), 最低的1#和 9#分別較 8#降低 76.35%、64.15%; 較低的 3#和 7#差異不顯著; 低魚粉組 11#和高魚粉組 2#、6#也無顯著差異。

圖2 蛋白質和脂肪互作對飼料系數的效應Fig.2 Effects of protein and lipid interactions on FCR

圖3 蛋白質和魚粉互作對飼料系數的效應Fig.3 Effects of protein and fish meal interactions on FCR

表2 主要營養(yǎng)素源組合對暗紋東方鲀生長和飼料利用的影響Tab.2 Effects of the main nutritional element and source combination on the growth and feed utilization in Takifugu puffer

2.1.4 增質量率和飼料系數的對應關系

12種營養(yǎng)素源組合飼糧下, 暗 紋東方 鲀 的增質量率和飼料系數的對應關系(圖4)表明, 增質量率和飼料系數呈明顯的負相關關系, 即增質量率越低,相應的飼料系數越高, 符合常規(guī), 表明生長試驗數據客觀而可信。

圖4 主要營養(yǎng)素源組合對增質量率和飼料系數的影響對應趨勢Fig.4 Trend of the main nutrient element and source combination effects on WGR and FCR

2.2 消化酶活性

12種不同營養(yǎng)素源組合飼糧下, 暗 紋東方 鲀 的消化酶活性結果見表3。

2.2.1 胰蛋白酶

表3中胰蛋白酶活性結果表明, 單、雙、3因素互作均有顯著或極顯著影響(P＜0.05或0.01)。P43、P40分別與魚粉互作效應顯著(圖5)。L10FL互作效應顯著優(yōu)于 L7FL、L10FH、L7FH(圖6)。3因素互作差異極顯著(P＜0.01), 9#活性最高, 8#、7#次之。

圖5 蛋白質和魚粉互作對胰蛋白酶活性的效應Fig.5 Effects of protein and fish meal interactions on trypsin activity

圖6 脂肪和魚粉互作對胰蛋白酶活性的效應Fig.6 Effects of lipid and fish meal interactions on trypsin activity

2.2.2 腸脂肪酶、淀粉酶

表3中腸脂肪酶和淀粉酶活性結果表明, 脂肪、魚粉單因素對二者活性均有顯著或極顯著影響(P＜0.05或0.01)。雙因素蛋白質和脂肪互作對腸淀粉酶活性, 蛋白質和魚粉互作對二者活性, 均有顯著影響 (P＜0.05), P40L10互作和 P43FH 互作效應顯著。3因素互作差異極顯著(P＜0.01), 9#腸脂肪酶活性最高、11#、7#、1#次之; 3#腸淀粉酶活性最高, 1#、9#次之。

2.2.3 肝胰脂肪酶、淀粉酶

表3中肝胰臟脂肪酶和淀粉酶結果表明, 單因素均有極顯著影響(P＜0.01)。雙因素蛋白質和脂肪互作對二者活性均有極顯著影響(P＜0.01); 蛋白質和魚粉互作對脂肪酶活性, 脂肪和魚粉互作對淀粉酶活性均影響極顯著(P＜0.01)。3因素互作均無顯著差異(P＞0.05)。

表3 主要營養(yǎng)素源組合對消化酶活性的影響Tab.3 Effects of the main nutritional element and source combination on digestive enzymes activities

2.3 吸收酶活性

12種不同營養(yǎng)素源組合飼糧下, 暗 紋東方 鲀 的吸收酶活性結果見表4。表4中吸收酶活性結果表明,單因素脂肪水平對二者活性均有極顯著影響(P＜0.01), 蛋白質水平僅對 Na+-K+-ATP酶活性影響極顯著。其他單、雙、3因素互作均差異不顯著(P＞ 0.05),仍看出1#活性最高, 3#、9#次之, 7#、2#、11#較高。

表4 主要營養(yǎng)素源組合對吸收酶活性的影響Tab.4 Effects of the main nutritional element and source combination on absorption enzymes activities

2.4 水環(huán)境指標

12種不同營養(yǎng)素源組合飼糧下, 暗紋東方鲀的養(yǎng)殖水環(huán)境指標結果見表5。

2.4.1 氨氮

表5中氨氮濃度結果表明, 蛋白質、魚粉單因素均影響極顯著(P＜0.01)。雙因素蛋白質和脂肪互作差異極顯著(圖7)。3因素互作差異不顯著(P＜0.05), 仍看出12#濃度最低, 7#、11#次之。

圖7 蛋白質和脂肪互作對氨氮濃度的效應Fig.7 Effects of protein and lipid interactions on ammonia nitrogen concentrations

2.4.2 磷酸鹽

由表5中磷酸鹽濃度結果可見, 脂肪、魚粉單因素分別影響顯著或極顯著(P＜0.05或0.01)。雙因素脂肪和魚粉互作影響顯著(圖8)。3因素互作有極顯著影響(P＜0.01), 11#濃度最低, 與1#、9#無顯著差異。

圖8 脂肪和魚粉互作對磷酸鹽濃度的效應Fig.8 Effects of lipid and fish meal interactions on phosphate concentrations

2.4.3 亞硝酸氮、COD

由表5可以看出, 僅魚粉單因素對COD有極顯著影響(P＜0.01)。雙因素脂肪和魚粉互作、3因素互作顯著或極顯著影響亞硝酸氮(P＜0.05或0.01)。

表5 主要營養(yǎng)素源組合對水環(huán)境指標的影響Tab.5 Effects of the main nutritional element and source combination on water environmental indicators

3 討論

3.1 主要營養(yǎng)素源組合對生長和飼料利用的影響

紅鰭東方 鲀 的研究表明, 幼稚魚生長和生理機能最佳時, 蛋白質含量為 50%±3.7%[4]、41.08%[5]和41%[6]。當脂肪含量為 8.93%時, 幼魚生長代謝機能最佳[8], 且含量小于11%時, 脂肪含量的提高才會增強其生長性能[7]。 暗紋東方 鲀 研究僅見蛋白質含量為46%～49%時, 幼魚生長和飼料利用最佳[12]。適宜脂肪、魚粉需求的研究仍未見有。主要營養(yǎng)素源組合對暗紋東方 鲀 的生長效應研究尚屬空白。

本研究表明, 1#生長效果最佳, 其增質量率最高,飼料系數最低; 9#次之, 且與1#差異不顯著; 3#、11#和7#相對表現也較佳。1#和3#分別顯著或極顯著改善生長性能, 符合常規(guī), 因其營養(yǎng)素源組合高優(yōu)。而值得討論的新發(fā)現是, 低魚粉組9#和11#、7#分別顯著或明顯改善生長和飼料利用, 營養(yǎng)素源組合正效應突出, 更加節(jié)約魚粉資源和降低飼糧成本, 具有重要理論機制探討意義和難得經濟實用推廣價值。

由試驗 3因素方差分析知, 單因素蛋白水平對增質量率、魚粉水平對飼料系數均無顯著影響(P＞0.05),高脂肪顯著改善增重和飼料利用, 中蛋白顯著降低飼料系數; 雙因素 P40FL改善增質量率和飼料系數的效應均與 P43FH差異不顯著, P40L10顯著降低飼料系數。故 9#中蛋白高脂肪低魚粉組合顯著改善生長性能的原因包含其中。11#由于替換為低蛋白, 效果顯著低于 9#, 但與高魚粉組 3#無顯著差異, 也包含上述單雙因素效應的原由。

再從營養(yǎng)學機制和前人研究結果分析, 9#、11#飼糧魚粉比例較低, 但均為高脂肪水平, 加之補充優(yōu)質動植物蛋白源(美國肉骨粉、酵母蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白等)間及與魚粉組合后的總體交互作用(氨基酸、脂肪酸、活性物等互補互作)正效應較強,使總體生產性能結果不同程度分別接近 1#、3#; 當提供適量脂肪作為能源時, 蛋白質的需要量可以降低或被節(jié)約[14], 也是9#、11#顯著改善生長效果的主要原因所在。已有研究表明, 高脂肪有助于紅鰭東方鲀幼魚的生長, 對降低飼料系數有一定影響, 同時可促進魚體代謝[8]。低魚粉水平時, 可通過增加油脂使用量, 提高代謝能, 使消化過程中能量消耗減少,熱增耗降低, 凈能增加, 充分體現脂肪增效作用[15]。

3.2 主要營養(yǎng)素源組合對消化吸收的影響

東方 鲀 消化酶研究, 多見環(huán)境因子[16-17]和無機離子[18]對蛋白酶活性的影響, 而脂肪酶、淀粉酶研究甚少。堿性磷酸酶可以協助魚體腸上皮細胞吸收脂類、葡萄糖、氨基酸等[19], Na+-K+-ATP 酶活性可間接反映小腸黏膜的吸收功能[20], 二者活性研究曾見建鯉幼魚飼糧蛋白質的影響[21], 而主要營養(yǎng)素源組合對暗紋東方 鲀 的消化吸收性能研究仍屬空白。

由本研究消化吸收性能結果可知, 低魚粉組9#、11#、7#顯著或明顯提高胰蛋白酶和腸脂肪酶活性,而對堿性磷酸酶和 Na+-K+-ATP 酶活性無顯著影響,同時高脂肪具有增強多數消化吸收酶活力的作用。此結果特征與本試驗生產性能結果相一致, 可視為低魚粉組9#、11#、7#和高脂肪因素顯著改善生長性能的消化生理原因。

由試驗 3因素方差分析得, 單因素高脂肪極顯著提高多數消化吸收酶活性; 低魚粉顯著提高胰蛋白酶和腸脂肪酶活性; 高、中蛋白顯著提高胰蛋白酶和Na+-K+-ATP酶活性。雙因素P40L10顯著提高胰蛋白酶活性(且與P43L10無顯著差異)和腸、肝胰淀粉酶活性; P40FL顯著提高腸脂肪酶活性。兩種吸收酶的雙因素互作效應不顯著, 但高脂肪單因素提高二者活性的效應仍較明顯。9#多數消化酶活性強、吸收酶活性改善的原因從而得以解釋。7#、11#酶活較高的原因也包含在單雙因素效應之中。

增加飼糧脂肪可提高魚體脂肪酶活力, 反之降低[22]; 低魚粉組適宜的動植物蛋白比例一定程度的刺激消化酶分泌, 提高各種營養(yǎng)的消化率和蛋白質利用率[23-24]; 且玉米蛋白粉對魚體消化道生理環(huán)境及消化吸收率的干擾較少[24], 加之脂肪的節(jié)約效應,表現為低魚粉組9#消化酶活性顯著提高。飼糧蛋白可誘導魚體蛋白酶分泌, 促進蛋白質的消化與吸收[25],故7#、9#的高、中蛋白水平使得胰蛋白酶活性較高。高、中蛋白水平下Na+-K+-ATP酶活性也較高, 有利于腸道內營養(yǎng)物質的消化后吸收。這一結果特征在豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus)也有發(fā)現[26]。大菱鲆(Psetta maxima)為適應植物性蛋白源豆粕含量的增加, 蛋白酶活力有增大趨勢[27], 也與本研究結果相符。研究還發(fā)現, 高魚粉組其淀粉酶活性較高, 但肉食性魚類淀粉酶對消化性能的作用微弱[28]。

3.3 主要營養(yǎng)素源組合對養(yǎng)殖水環(huán)境的影響

本研究中, 除 COD外, 氨氮、亞硝酸氮、磷酸鹽三指標的相對濃度變化呈現出相似趨勢或特征,即高魚粉組及低魚粉高蛋白組的含量普遍高于其他低魚粉組, 以11#、9#、7#、1#相對較低; 亞硝酸氮、磷酸鹽二指標相對濃度變化出現組間顯著差異,9#、11#、1#不同程度顯著降低; 另外發(fā)現, 高脂肪具有降低水體磷酸鹽和COD 的趨勢。

由試驗 3因素方差分析結果可知, 單因素低魚粉極顯著降低氨氮、磷酸鹽、COD濃度, 也有明顯降低亞硝酸氮濃度的趨勢; 高脂肪顯著降低磷酸鹽濃度, 且有明顯降低 COD的趨勢; 高、中蛋白極顯著提高氨氮濃度。雙因素L10FL顯著降低亞硝酸氮濃度, L10與FH、FL互作均降低磷酸鹽濃度; P43L10可顯著降低氨氮濃度。由此說明11#、9#、7#高脂肪低魚粉組合顯著改善水環(huán)境的原因。1#因互作效應顯著降低氨氮、磷酸鹽濃度, 也使水質明顯改善。

由于不同營養(yǎng)水平組合的不同互作產生的正負效應, 導致不同處理組試魚生長和飼料利用的差異,使除 1#外的其他高魚粉組的增質量率、飼料系數與低魚粉組相近, 而前者飼糧均不同程度含有較高質量和數量的氮磷營養(yǎng)(蛋白質、氨基酸、有效磷等), 造成氮磷食入多、消化吸收少、排泄多, 從而導致氨氮、亞硝酸氮、磷酸鹽相對濃度較高。已有研究表明[23], 提高飼糧脂肪一定程度降低氮排泄率, 低蛋白水平可顯著降低氨氮濃度, 低蛋白和高脂肪互作可有效降低大西洋鮭(Salmo salar)的氨氮排泄量。另有研究證實, 大豆?jié)饪s蛋白和玉米蛋白粉可降低歐洲狼鱸的總磷排放, 增加磷儲留[29]; 多種蛋白源混合飼料在不影響魚生長性能的情況下, 具有較低磷排泄[30], 均與本研究相符;同時, 本試驗低魚粉組飼糧的總磷含量偏低, 也是水體磷酸鹽含量低的原因之一。

4 結論

主要營養(yǎng)素源及其互作顯著影響暗紋東方 鲀 的生長、消化吸收和水環(huán)境。1#、9#生長性能顯著提高, 3#、11#和 7#明顯提高; 低魚粉組 9#、11#、7#顯著提高胰蛋白酶和腸脂肪酶活性, 高脂肪極顯著提高吸收酶活力; 低魚粉中低蛋白組的氨氮、亞硝酸氮、磷酸鹽相對濃度變化呈現普遍低于其他處理組的特征。值得關注的新發(fā)現是, 低魚粉組9#、11#、7#營養(yǎng)素源組合正效應突出, 節(jié)約魚粉資源且降低飼糧成本, 具有重要理論和應用價值。下一步工作需在本研究基礎上, 進行效應顯著低魚粉組(9#、11#、7#)的重復試驗, 以最終確定其顯著效果, 及早應用到生產實踐中。

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