寧曄鳳 , 黎中寶 , 戴 剛 , 上官靜波 , 李清薈

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 福建 廈門361021)

中國鱟(Tachypleus tridentatus)又名三刺鱟、小海鱟或東方鱟, 是大型海洋底棲動物, 其祖先可追溯至4億多年前, 是動物界少數(shù)現(xiàn)存珍貴的“活化石”[1]。它隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)、鱟科(Limulidae)、鱟屬(Tachypleus), 主要分布于中國長江口以南、日本九州島以南、爪哇島以北海域[2]。中國鱟具有極高的經(jīng)濟、藥用及科學(xué)研究價值, 其血液制品鱟試劑是目前檢測內(nèi)毒素應(yīng)用最廣、最有效的試劑[3], 且其微妙的視神經(jīng)系統(tǒng)使得它成為生理學(xué)和仿生學(xué)研究的重要模型[4]。然而近些年來, 棲息地生境的破壞、人類大規(guī)模濫捕濫殺等原因造成了中國鱟數(shù)量銳減, 野生資源幾近枯竭[5], 加之其生長周期從卵細胞受精至成熟需要 13~15年, 中國鱟的保育工作迫在眉捷[6]。目前,福建、浙江、廣東、海南及廣西省已將中國鱟列為省級重點保護動物, 因此, 進行中國鱟資源保護及開展相關(guān)基礎(chǔ)研究顯得十分需要。

微衛(wèi)星即為簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat, STR), 是由中央核心序列和兩側(cè)保守側(cè)翼序列組成的, 核心序列為少數(shù)幾個核苷酸(2~6個)組成的串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列。由于微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記技術(shù)所具有的易分離、共顯性、多態(tài)性高、信息含量多、關(guān)聯(lián)性好等優(yōu)點[7], 使得其在物種遺傳多樣性分析研究上比其他DNA標(biāo)記技術(shù)更適合, 并因此在瀕危動物種群遺傳學(xué)及保護遺傳學(xué)中得到越來越多的應(yīng)用[8-9]。中國鱟作為重要的野生保護動物之一, 目前國內(nèi)對中國鱟的研究多見于資源分布及保育方面[10-11],中國鱟微衛(wèi)星標(biāo)記分離方面的研究還有很大空缺,目前相關(guān)研究僅見于Li等[12]開發(fā)出7對多態(tài)微衛(wèi)星引物。

本研究采用生物素標(biāo)記的(GT)15、(CT)15混合探針雜交與磁珠富集法相結(jié)合從中國鱟基因組中構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫, 通過克隆、測序、設(shè)計引物和PCR檢測來獲得多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記, 為進一步研究中國鱟群體遺傳多樣性, 種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析奠定基礎(chǔ),且為其野生種質(zhì)資源保護及評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中國鱟樣品采自福建省廈門市集美水產(chǎn)品市場,平均體長為35.6 cm。剪取樣品附肢肌肉于95%乙醇中固定, 并于–20℃保存。

1.2 基因組 DNA 的提取與檢測

基因組 DNA采用試劑盒提取法。具體操作步驟按照天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒-離心柱型/DP304(天根生化科技有限公司, 北京)的說明書進行。經(jīng)K5500超微紫外分光光度計測定所提基因組 DNA 的純度和濃度后, 取 2 μL 基因組DNA 進行 1%瓊脂糖凝膠小樣量樣品電泳檢測其DNA完整性, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶切及接頭連接

基因組DNA選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)進行快速酶切, 并選取400 bp~1 000 bp片段進行連接。等摩爾比混合兩組寡核苷酸鏈 LinkerA(5'-GACGATGAGTCCTGAG-3')及LinkerB (5'-TACTCA GGACTCAT-3'), 95℃變性10 min, 37℃10 min, 冰置10 min, 形成終濃度為 10 μmol/L 的雙鏈接頭供連接體系使用。

建立30 μL的連接體系, 其中包括酶切產(chǎn)物20 μL,雙鏈接頭 5μL (10μmol/L), T4 連接酶(5 U/μL)1 μL,10×T4 buffer 4 μL, 于 22℃連接過夜。

1.4 微衛(wèi)星文庫的構(gòu)建

1.4.1 雜交

將10 μL接頭連接產(chǎn)物于95℃變性 10 min, 迅速置于冰上使雙鏈分開。取變性后的連接產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的 Bio-(CT)15、Bio-(GT)15混合探針進行雜交反應(yīng), 反應(yīng)體系為 50 μL , 其中包括 25 μL 已預(yù)熱至55℃的緩沖液2×Hyb buffer, 10 μL 接頭連接產(chǎn)物, 5μL Bio-(CT)15(10μmol/L), 5 μL Bio-(GT)15(10 μmol/L) 以及 5 μL ddH2O。61℃雜交 1 h, 放置 4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 磁珠富集純化

1.4.2.1 平衡磁珠

取150 μL混勻后的磁珠(Promega, USA)原液于1.5 mL離心管。而后置于磁力架上吸附磁珠, 輕輕吸出上清鹽保護液。用150 μL(等比例)0.5×SSC于室溫下洗滌磁珠兩遍, 最后加入150 μL 1×Hyb buffer重懸磁珠。

1.4.2.2 磁珠的富集

于已平衡好的重懸磁珠液中加入 50 μL雜交產(chǎn)物混勻, 室溫下放置30 min, 期間每5 min用移液槍輕輕吹打混勻 1 次, 30 min 后將離心管置于磁力架上,吸去上清液。之后將離心管放置于磁力架上于室溫下依次用 400 μL 洗脫液 I(2×SSC, 0.1% SDS)和400 μL 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1% SDS)各洗脫2次。最后再用已提前預(yù)熱至 50℃的 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1%SDS)400 μL快速洗脫兩次。即可基本將不含微衛(wèi)星的以及與探針結(jié)合不牢固的片段去除干凈。

1.4.2.3 捕獲微衛(wèi)星片段

洗脫完成后, 在洗脫液中加入200 μL TE混合均勻, 95℃溫育 10 min后, 將釋放出含有單鏈微衛(wèi)星序列的片段, 迅速將其置于磁力架上吸取上清液轉(zhuǎn)至新離心管中。

1.4.2.4 純化富集微衛(wèi)星片段

在上述制備好的含有微衛(wèi)星片段的溶液中加入400 μL, –20 ℃ 預(yù)冷的無水乙醇, 并加入 22 μL NaAc/EDTA(pH8.0)螯合劑助沉, 冰置15 min后4℃, 12 000 r/min 離心 10 min, 棄上清。再加入 500 μL, –20℃預(yù)冷的 75%乙醇, 冰置 15 min后4℃, 12 000 r/min離心10 min, 棄上清, 室溫風(fēng)干樣品。最后用25 μL TE溶液溶解微衛(wèi)星DNA, 放置4℃過1~2 d待微衛(wèi)星 DNA 充分溶解后方可使用。

1.5 產(chǎn)物擴增及純化

建立 25 μL 擴增體系, 用 MseI primer(MseI adapterA)為引物對富集純化所得微衛(wèi)星 DNA 片段進行 PCR 擴增。擴增體系包括精制產(chǎn)物2 μL, 10×Taq Buffer(含 Mg2+) 4 μL, dNTPs(10mmol/L)0.4 μL, Taq聚合酶(5U/μL)0.2 μL, MseI primer 引物 1.4 μL(10 μmol/L), 17 μL ddH2O。PCR 擴增條件為: 95℃預(yù)變性 2 min, 32×(95℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 40 s),最后 72℃, 20 min 完成擴增片段末端加poly A。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段。選取片段400 bp~1 000 bp的產(chǎn)物, 用 GenCleanPCR回收試劑盒(上海捷瑞)純化, 去除多余的dNTPs 和接頭等雜質(zhì)。

1.6 載體連接、富集文庫的篩選及測序

取2 μL純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(Takara, Japan)于16℃連接3.5 h, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌 DH5α中培養(yǎng), 得到中國鱟微衛(wèi)星基因組文庫。挑選陽性單克隆菌接種于含有氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中, 37℃振蕩培養(yǎng) 3.5 h。隨后用 M13F/R通用引物進行 PCR 擴增篩選檢測, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物, 挑取片段為400 bp~1 000 bp的陽性克隆菌液送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.7 序列分析與引物設(shè)計

利用 NCBI載體查找工具 VecScreen 去除兩側(cè)的載體引物, 匯總所有輸出序列后再利用微衛(wèi)星查找軟件SSRHunter 1.3 對重復(fù)序列進行查找。獲得的微衛(wèi)星序列按完美型, 非完美型和復(fù)合型人工細化分析。并用 Primer Premier version 5.0對所得的微衛(wèi)星序列進行引物設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆與測序結(jié)果

經(jīng)PCR檢測篩選, 本研究共獲得334個陽性克隆,從中隨機選取196個片段大小為400 bp~1 000 bp的陽性克隆送出測序。圖1為部分篩選結(jié)果的電泳圖。

圖1 單克隆檢測結(jié)果Fig.1 Partial results of the positive monoclonal PCR detection

2.2 微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分析

在送出的 196個陽性克隆的測序過程中, 有 18條微衛(wèi)星序列測序出現(xiàn)中斷, 測序失敗, 占所有克隆的9.08%。這部分的測序結(jié)果顯示, 在單個克隆中有多處微衛(wèi)星重復(fù)序列, 有的甚至高達 6 處, 并且重復(fù)次數(shù)通常大于30次, 復(fù)雜的堿基重復(fù)可能是導(dǎo)致測序過程出現(xiàn)信號衰減、測序峰圖紊亂、測序中斷的原因。圖2為單向測序測通的中國鱟基因組中微衛(wèi)星的特征序列部分峰圖。

圖2 中國鱟基因組中微衛(wèi)星特征序列(CAAA)nFig.2 Diagram of (CAAA)n repeat sequence in Tachypleus tridentatus

本研究利用磁珠富集獲得的中國鱟基因組微衛(wèi)星最大重復(fù)次數(shù)為 98次, 大多集中在 7~35次, 占82.6%; 最高在5~10次, 為29.5%, 多數(shù)是二核苷酸堿基重復(fù)7次以上的微衛(wèi)星序列; 50次以上的頻率為10.2%(圖3)。

圖3 中國鱟微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)與分布頻率Fig.3 Distribution frequency of microsatellite repeat times in Tachypleus tridentatus

2.3 微衛(wèi)星序列結(jié)果及分類

利用SSR hunter 1.3軟件對去除載體引物后的序列進行微衛(wèi)星序列的查找, 使用的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Linda[13]對微衛(wèi)星的劃定標(biāo)準(zhǔn): 單堿基重復(fù)大于 14次, 雙堿基重復(fù)大于7次, 三堿基重復(fù)大于5次, 四堿基及五堿基重復(fù)大于4次。結(jié)果顯示, 在178個成功測序的陽性克隆中共獲得 127個微衛(wèi)星序列, 其中完美型占 69.3%; 非完美型占 11.0%; 復(fù)合型 占 19.7%(表1)。除探針使用的GT和CT的重復(fù)序列外, 還篩選到多堿基 GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA 的重復(fù)序列。部分微衛(wèi)星詳細信息可見表2。

表1 中國鱟基因組微衛(wèi)星序列分類情況Tab.1 Systematization of microsatellites in T.tridentatus

表2 部分微衛(wèi)星位點引物及其他相關(guān)信息Tab.2 Relevant information of part of microsatellite primer sequences of T.tridentatus

2.4 引物設(shè)計及擴增結(jié)果分析

利用引物設(shè)計軟件 Primer Premier version 5.0對所得到的序列設(shè)計引物, 在 127個微衛(wèi)星序列中,有43個微衛(wèi)星座位由于位于序列的末端或沒有足夠的側(cè)翼序列無法設(shè)計, 在有側(cè)翼的 84個序列中, 然后為選定的序列設(shè)計 PCR引物, 在 moderate stringency條件下[溫度: 45.0~70.0℃, GC含量: 40%~60%; 引物長度: (21±4) bp; PCR產(chǎn)物大小: 100~330 bp], 有56個序列可設(shè)計出引物, 本研究選擇合成40對, 其中有19對可擴增出清晰目的條帶, 16對表現(xiàn)出單一條帶, 3對表現(xiàn)出多態(tài)性。圖4為TF-4位點擴增圖譜。目的片段為237bp處, 顯示出多態(tài)性。

圖4 中國鱟TF-4位點擴增圖譜Fig.4 Electrophoretogram of TF-4 locus in T.tridentatus

3 討論與結(jié)論

3.1 酶切片段的大小及酶的種類

構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫文庫時, 使用的酶切片段大小應(yīng)適宜, 過長的片段易導(dǎo)致親和捕捉不到, 后續(xù)難以擴增, 影響測序結(jié)果, 增加實驗成本; 過短的片段則很難保證微衛(wèi)星側(cè)翼序列長度, 影響引物的設(shè)計, 進而影響多態(tài)性引物的篩選。從便于提高實驗有效性角度來看, 本實驗選用400~1 000 bp大小的酶切片段是合理的。在選擇限制性內(nèi)切酶上, 本實驗選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)是由于其酶切位點在動物基因組中分布廣泛, 可以將基因組DNA均勻地切成大小不同的片段, 且反應(yīng)速度很快, 大大縮減了實驗用時, 既保證了實驗準(zhǔn)確性、微衛(wèi)星位點隨機性, 又保證了實驗結(jié)果的高效性和真實性。

3.2 探針的選擇

在所有動物基因組中(CA)n或(GT)n微衛(wèi)星的含量最為豐富, 其次是(CT)n[14]。本研究選用(GT)n為探針進行富集和雜交。為了提高微衛(wèi)星的富集效率,Edwards[15]等提出用多種探針來篩選文庫被廣泛應(yīng)用。Stamati[16]等利用(CA)15、(GA)8、(AAG)8和(ATG)8為探針構(gòu)建了Salix lanata基因組文庫, 李齊發(fā)等[17]選擇(CA)12、(CCG)8、(CAG)8和(TTTC)8混合探針富集牦牛微衛(wèi)星, 均證實了應(yīng)用多種探針混合進行雜交分離微衛(wèi)星片段是增加微衛(wèi)星種類的理想選擇。因此本研究在(GT)15的基礎(chǔ)上又采用了(CT)15探針,以期獲得更多的微衛(wèi)星標(biāo)記位點。此外, 探針選用時堿基數(shù)要適中, 探針堿基對的增加會直接影響到雜交的效率, 堿基對越多越難雜交。所以在以后的研究中, 根據(jù)研究對象特點選用相應(yīng)合適的混合探針,是成功獲得更多微衛(wèi)星種類的必要條件。

3.3 微衛(wèi)星序列特征及擴增結(jié)果分析

本研究中獲得的微衛(wèi)星序列中, 完美型微衛(wèi)星占69.3%、不完美型占11.0%、復(fù)合的占19.7% 其中完美型微衛(wèi)星比例最高, 此結(jié)果與日本盤鮑(Paralichthys olivaceus)[18]、細角螺(Hemifusus ternatanus)[19]、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[20]、劍尾魚(Xiphophorus helleri)[21]、海灣扇貝(Argopecten irradians)[22]以及大珠母貝(Pinctada maxima)[23]等水產(chǎn)動物的微衛(wèi)星序列特點基本相符。微衛(wèi)星核心序列相對較高的突變率, 是微衛(wèi)星多態(tài)性的基礎(chǔ)。根據(jù)Weber等[24]的觀點, 重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星在種群中表現(xiàn)出的多態(tài)性高。本研究所得序列重復(fù)次數(shù)多集中在7~35, 占82.6%, 最高達到98次。但是高重復(fù)性序列往往周圍側(cè)翼序列不足, 或是1個克隆中出現(xiàn)多處微衛(wèi)星序列, 復(fù)雜的堿基重復(fù), 導(dǎo)致測序峰圖紊亂以至于引物設(shè)計困難。

本實驗研究顯示, 合成的引物 40對經(jīng)擴增后,有19對可擴增出清晰目的條帶。其中有16對表現(xiàn)出單一條帶, 3對具有多態(tài)性。其余的因存在無擴增產(chǎn)物, 擴增產(chǎn)物與目的條帶長度不一致, 擴增圖譜個體缺失嚴(yán)重等導(dǎo)致無法判定。出現(xiàn)這些情況的原因可能是由于某些引物序列特異性不好, 無法擴增出產(chǎn)物, 某些引物與基因組中序列錯配, 導(dǎo)致擴增產(chǎn)物長度改變, 或是有些個體基因突變, 無法與引物結(jié)合。本實驗篩選出的微衛(wèi)星引物可為中國鱟遺傳多樣性分析的進一步研究奠定基礎(chǔ), 為以后中國鱟的遺傳育種、種苗放流等提供基礎(chǔ)理論依據(jù), 這對于后期實現(xiàn)其種質(zhì)資源保護及科學(xué)的管理具有重要意義。

[1] 翁朝紅, 謝仰杰, 洪水根, 鱟血淋巴系統(tǒng)的特點及其功能[J].集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)[J].2003, 8(1): 16-21.

[2] Sekiguchi K.Biology of horseshoe crabs[M].Tokyo:Science House CO., Ltd.1988: 1-9.

[3] Swan B L.A unique medial product (LAL) from the horseshoe crab and monitoring the Delaware Bay horseshore crab population.In: Limulus in the limelight[M].New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2001: 53-62.

[4] 洪水根.中國鱟生物學(xué)研究[M].廈門: 廈門大學(xué)出版社, 2011: 10-11.

[5] 黃勤, 林能鋒, 陳英祿, 等.平潭中國鱟保護區(qū)規(guī)劃建議[J].福建環(huán)境, 2003, 20(4): 35-38.

[6] 李瓊珍.中國鱟保育工作研究進展[J].生物學(xué)雜志,2010, 27(4): 71.

[7] 王偉, 尤峰, 高天翔, 等.魚類微衛(wèi)星標(biāo)記的研究進展[J].海洋科學(xué), 2006, 30(10): 81-86.

[8] Cao Y Y, Li Z B, Li Q H, et al.Development and characterization of microsatellite loci forFenneropenaeus penicillatusAlock[J].African Journal of Biotechnology,2012, 11(48): 10831-10833.

[9] Dai G, Li Y Y, Li Z B, et al.Isolation and characterization of twelve novel polymorphic microsatellite loci in theBranchiostoma belcheriGray (Amphioxus)[J].Conservation Genet Resource, 2013, 5(4): 1115-1116.

[10] 廖永巖, 李曉梅.中國海域鱟資源現(xiàn)狀及保護策略[J].資源科學(xué), 2001, 23(2): 53-57.

[11] 翁朝紅, 肖志群, 謝仰杰, 等.創(chuàng)建廈門海域中國鱟自然保護區(qū)[J].集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008,13(1): 40-44.

[12] Li Q Z, Li Q, Liu J, et al.Isolation and characterization of microsatellite loci in the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus)[J].Conservation Genet Resource, 2009, 10:1879-1881.

[13] Linda C, Luke R, Dan M, et al.Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants [J].Genetics, 2000,156(2): 847-854.

[14] Brenner S, Elgar G, Sandford R, et al.Characterization of the pufferfish(Fugu)genome as a compact model vertebrate genome[J].Nature, 1993, 366: 265-268.

[15] Edwards K J, Baker J H, Daly A, et al.Microsatellite libraries enriched for several microsatellite sequences in plants[J].Biotechniques, 1996, 20: 758-760.

[16] Stamati K, Blackie S, Brown J W S, et al.A set of polymorphic SSR loci for subarctic williow(Salix Lanata,S.lappommandS.herbacea)[J].Molecular Ecology Notes, 2003, 2: 280-282.

[17] 李齊發(fā), 趙興波, 羅曉林, 等.牦牛基因組微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建與分析[J].遺傳學(xué)報, 2004, 31(5): 489-494.

[18] Sekino M, Hara M.Isolation and characterization microsatellite DNA loci in Japan flounderParalichthys olivaceus[J].Molecular Ecology, 2000, 9: 2201-2203.

[19] 李清薈, 陳曉姣, 黎中寶, 等.細角螺微衛(wèi)星 DNA富集文庫構(gòu)建及特征分析[J].海洋科學(xué), 2013, 37(4): 1.

[20] 徐鵬, 周嶺華, 相建海, 中國對蝦微衛(wèi)星 DNA 的篩選[J].海洋與湖沼, 2001, 32(3): 225-259.

[21] 李霞, 白俊杰, 吳淑勤, 等.劍尾魚微衛(wèi)星 DNA的篩選[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(3): 196-201.

[22] 李宏俊, 劉曉, 杜雪地, 等.海灣扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及其分離方式分析[J].海洋科學(xué), 2009 , 33(12): 4-8.

[23] 柳明, 喻達輝, 黃桂菊.大珠母貝微衛(wèi)星 DNA 標(biāo)記的分離與篩選[J].海洋科學(xué), 2010, 34(8): 1-5.

[24] Weber J L.Informativeness of human (dC-dA)n (dG-Dt)n ploymorphisms[J].Genomics, 1990, 7(3): 524-530.