呂翠巖，張勝容，趙文景，蔡 朕，鄭桂敏，趙 靜，王 暉，姜媛媛，陳洋子，劉銅華

(1．首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100010;2．北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)BDNF蛋白及BDNFmRNA表達的影響*

呂翠巖1，2，張勝容1，趙文景1，蔡 朕1，鄭桂敏1，趙 靜1，王 暉1，姜媛媛1，陳洋子1，劉銅華2△

(1．首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100010;2．北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

目的:觀察中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白及BDNFmRNA表達的影響。方法:采用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)2型糖尿病大鼠動物模型，用不同劑量的糖痹康灌胃并與甲鈷胺對照，16周后取大鼠一側坐骨神經(jīng)，用免疫組化法檢測坐骨神經(jīng)中BDNF蛋白的表達及采用RTPCR方法檢測坐骨神經(jīng)組織中BDNF mRNA的表達。結果:與正常組比較，模型組BDNF蛋白表達顯著降低及BDNF mRNA表達顯著降低;糖痹康組與模型組比較，能升高BDNF蛋白及BDNF mRNA表達。結論:中藥復方糖痹康能夠促進糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)BDNF mRNA的轉錄和蛋白的表達。

糖痹康;糖尿病;周圍神經(jīng)病變;坐骨神經(jīng);腦源性神經(jīng)生長因子

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是目前常見的糖尿病并發(fā)癥之一［1］，也是導致糖尿病病人足潰瘍最主要的原因。DPN發(fā)病機制十分復雜，非單一因素所致，目前尚未完全闡明，造成西醫(yī)對其治療存在一定的局限性和有效性，而中醫(yī)對其治療有多種有效手段，具有綜合調(diào)節(jié)優(yōu)勢。劉銅華教授經(jīng)過多年的臨床研究，認為本病主要病機為“氣陰不足，毒瘀神絡”，并提出“益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀通絡”的新治療原則。中藥復方糖痹康是在這一治則指導下，在傳統(tǒng)經(jīng)方黃芪桂枝五物湯(《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》)基礎上，結合現(xiàn)代研究成果和臨床經(jīng)驗創(chuàng)制的，先后經(jīng)多年臨床驗證，不斷優(yōu)化處方，其組方及制備工藝已成功申報發(fā)明專利。為進一步探討糖痹康防治DPN的作用機制，本研究在前期研究的基礎上，選用SD大鼠，通過高脂飼料和小劑量STZ誘發(fā)2型糖尿病構建2型DPN動物模型［1］，以觀察糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織BDNF mRNA和蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量(160± 10)g，6周齡，購自北京維通利華動物實驗中心(動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2004-0009)。

1.2 材料及主要儀器

糖痹康(主藥為黃芪、女貞子、桂枝、黃芩、黃連等)由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供;甲鈷胺片(國藥準字H20030812)由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造;高脂飼料購自北京華阜康生物科技有限公司; Trizol試劑盒購自Invitrogen公司;PCR引物為生工生物工程(上海)有限公司;M-MLV反轉錄試劑盒購自Takara公司;Real-time PCR擴增試劑盒購自北京澤平生物技術有限公司;Agarose購自Promega公司;DEPC購自Sigma公司;100bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術有限公司;羅氏活力型血糖儀(ACCU-CHEK);7500型Real-Time PCR儀，美國ABI。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及分組 動物適應性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只為正常組，普通飼料喂養(yǎng);其余喂養(yǎng)高脂飼料，8周后STZ造模，給予35 mg/kg腹腔內(nèi)注射。72 h后用血糖儀測尾尖血糖，持續(xù)血糖水平≥16.7 mmol/L以上為造模成功，將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、甲鈷胺組、糖痹康低、中、高劑量組各10只。

1.3.2 給藥方法 造模成功且血糖穩(wěn)定3 d后開始灌胃。糖痹康低、中、高劑量組分別按成人劑量5、10、20倍給藥，即分別為生藥的4.175 g/kg/d、8.35 g/kg/d、16.7g/kg/d。甲鈷胺組按成人劑量10倍給藥，即1.97 mg/kg/d。實驗期間大鼠自由飲食飲水，連續(xù)給藥16周。

1.3.3 指標檢測及方法

①體質(zhì)量、血糖檢測:分別在給藥前和給藥后的4、8、12、16周末，禁食6 h，稱其體質(zhì)量及尾靜脈取血測空腹血糖。

②組織病理學觀察:16周末取2 cm左右大鼠坐骨神經(jīng)，放入4%多聚甲醛(不含DEPC)固定，石蠟包埋，4 μm切片，做HE染色，光鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織病理學變化。

③免疫組織化學檢測大鼠坐骨神經(jīng)BDNF蛋白表達:16周末取2 cm左右大鼠坐骨神經(jīng)，放入4%多聚甲醛(不含DEPC)固定，石蠟包埋，4 μm切片，采用SABC免疫組化法，一抗稀釋比為1∶50，顯色后中性樹膠封片。

④實時熒光定量檢測大鼠坐骨神經(jīng)BDNFmRNA表達:一部分大鼠坐骨神經(jīng)經(jīng)DEPC溶液處理后置入液氮凍存，待測BDNFmRNA。BDNF引物序列:BDNF，上游引物:5'-CTGGATGAGGA CCAGAAGGT-3'，下游引物:5'-CAGAAAGAGCAG AGGAGGCT-3'，117bp;參照基因 GAPDH序列: GAPDH，上游引物:5'-CAACTCCCTCAAGATTG TCAGCAA-3'，下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGT CATGA-3'，128 bp。首先，用Trizol提取獲取大鼠坐骨神經(jīng)組織總RNA，核酸紫外分光光度計測定經(jīng)稀釋RNA提取物的OD值和濃度，判斷RNA純度，計算RNA濃度。經(jīng)25 μL反轉錄體系:RNA 3 μl，Oligo(dT)1 μl，dd H2O(DEPC處理)9．5 μl，以上首先70℃孵育5 min，然后迅速放在冰上。5XBuffer 5 μl，dNTP(10 mM)5 μl，Ribonuclease inhibitor 0．5 μl，M-MLV RT 1 μl。以上42℃孵育60 min，然后70℃ 10 min，將所得的cDNA與引物1(10 pmol/μl) 0.5 μl，引物2(10pmol/μl)0.5 μl，SYBR mix10 μl，dd H2O7.5 μl加入20 μL Real-Time PCR體系，94℃預變性2 min，94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)，72℃ 10 min。

1．4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，2組以上組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

STZ注射72 h后，大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的采食量增加，尿量明顯增多，消瘦，精神不振，體毛色澤枯黃，缺乏光澤，豎毛弓背，活動明顯遲緩，反應遲鈍等。后期還相繼出現(xiàn)潰瘍、白內(nèi)障等糖尿病并發(fā)癥，甲鈷胺組和中藥糖痹康各治療以上情況組均有不同程度的改善。

2.2 體質(zhì)量

表1顯示，與正常組比較，干預8周、12周后，模型組大鼠體質(zhì)量有所降低(P＜0.05);干預16周后，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，干預16周后，糖痹康低、中劑量及甲鈷胺組體質(zhì)量顯著升高(P＜0.01)。

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量比較(±s，g)

表1 不同時間點各組大鼠體質(zhì)量比較(±s，g)

注:與空白組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 干預前干預后4周 8周 12周 16周正 常 組 10 411.12±16.12 430.75±34.70 467.25±58.50 486.13±18.69 514.13±10.99模 型 組 10 435.40±15.23 425.60±15.07 414.55±32.77* 408.20±36.79* 354.80±24.96＊＊甲 鈷 胺 組 10 426.11±50.76 430.89±33.80 429.22±28.13 434.11±29.16* 466.33±30.55*##糖 痹 康 低 10 427.33±19.73 438.00±21.81 448.60±36.82 457.44±38.85 482.56±36.15##糖 痹 康 中 10 416.90±45.89 423.10±47.73 442.90±59.48 450.11±70.67 484.70±32.46##糖痹康高 10 409.89±56.39 427.56±48.35 429.00±63.20 445.33±65.47 447.77±79.96

2.3 血糖檢測

表2顯示，與正常組比較，干預前及干預后各時間點模型組大鼠血糖值均顯著升高(P＜0.01);經(jīng)藥物干預后，各組大鼠與模型組比較血糖值均有不同程度的下降，其中甲鈷胺組(P＜0.05)和糖痹康低劑量組(P＜0.01)在干預16周后血糖值下降顯著，糖痹康中、高劑量組在干預后各時間點血糖值下降均較為顯著(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 不同時間點各組大鼠血糖比較(mmol/L±s)

表2 不同時間點各組大鼠血糖比較(mmol/L±s)

注:與空白組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 干預前干預后4周 8周 12周 16周正 常 組 10 5.72±0.48 5.88±0.83 6.09±0.32 6.28±0.51 6.45±0.46模 型 組 10 20.48±2.02＊＊ 22.16±1.65＊＊ 22.06±1.67＊＊ 22.47±1.04＊＊ 23.88±0.87＊＊甲鈷胺組 10 21.27±1.85＊＊ 21.03±1.79＊＊ 19.42±2.39＊＊ 20.29±2.19＊＊ 21.02±1.92＊＊#糖痹康低 10 23.19±1.60＊＊ 21.28±0.92＊＊ 20.30±2.37＊＊ 20.36±2.41＊＊ 19.93±2.21＊＊##糖痹康中 10 21.04±1.97＊＊ 19.42±2.40＊＊## 16.97±1.82＊＊# 16.33±1.78＊＊# 15.94±1.78＊＊##糖痹康高 10 21.59±1.26＊＊ 19.42±1.25＊＊## 12.99±1.91＊＊# 10.68±2.20＊＊## 9.74±2.15*##

2.4 病理學檢測

圖1顯示，正常組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結構緊密、分布均勻、排列整齊，可見半月形施萬細胞，且其結構完整、髓鞘薄厚均勻、著色均勻粉染(圖1A);模型組大鼠坐骨神經(jīng)纖維排列疏松、間隙變大、多處發(fā)生變性及斷裂，有髓神經(jīng)纖維密度分布不均勻且顯著減少，髓鞘變薄且著色不均勻，出現(xiàn)大量炎性病灶(圖1B);與模型組比較，甲鈷胺組大鼠坐骨神經(jīng)變性與斷裂顯著減少，神經(jīng)纖維結構緊密，但髓鞘仍較薄且著色不均勻，局部仍有炎癥反應發(fā)生(圖1C);而低劑量組、中劑量組及低劑量組與模型組比較顯示，低劑量組與中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)纖維的變性與斷裂顯著減少，但結構仍較疏松，髓鞘也未發(fā)生顯著變化，局部仍有炎癥反應發(fā)生(圖1D、E)，而高劑量組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結構緊密、排列整齊，未見變性與斷裂的發(fā)生，髓鞘變厚且著色均勻，炎性病灶相對減少(圖1F)。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片HE染色光鏡觀察結果(×100)

2.5 糖痹康對大鼠坐骨神經(jīng)組織BDNF蛋白及mRNA表達的影響

表3圖2顯示，BDNF主要分布于細胞漿中，其在正常大鼠的坐骨神經(jīng)中呈強陽性表達(圖2A);而與正常組比較，糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)中BDNF的表達顯著降低(P＜0.01，圖2B);給予甲鈷胺及糖痹康低、中、高劑量治療后，與模型組比較，BDNF在坐骨神經(jīng)中的含量均顯著升高，呈強陽性表達(P＜0.01，圖2C、D、E、F);與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)BDNFmRNA表達顯著降低(P＜0．01);甲鈷胺組和糖痹康低、中、高劑量組BDNFmRNA的表達與模型組比較均顯著升高(P＜0.01)。

表3 大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片BDNF蛋白及BDNFmRNA表達的變化(±s)

表3 大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片BDNF蛋白及BDNFmRNA表達的變化(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 例數(shù) 平均光密度值BDNFmRNA正 常 組6 126.61±28.65 0.92±0.18模 型 組 6 29.71±11.13＊＊ 0.23±0.06＊＊甲 鈷 胺 組 6 69.36±15.86## 0.49±0.12##糖 痹 康 低 6 79.47±16.94## 0.57±0.08##糖 痹 康 中 6 94.95± 3.73## 0.82±0.11##糖 痹 康 高 6 101.94± 7.21## 0.62±0.14##

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片BDNF免疫組織化學染色光鏡觀察結果(×400)

3 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor，NTF)是目前闡述DPN發(fā)病機制的一個主要學說。NTFs是機體產(chǎn)生的能夠促進神經(jīng)存活、生長、分化的一類蛋白因子，是由敏感神經(jīng)元的靶組織釋放，與特殊受體結合后，通過軸索逆向轉運進入細胞體，具有減少神經(jīng)變性、阻止疾病進程、刺激軸突生長、促進神經(jīng)修復和再生功能。該學說認為，神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成、分泌和代謝障礙是DPN發(fā)病的重要原因［3］。

腦 源 性 神 經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子 (brain derived neurotrophic factor，BDNF)是NTFs家族中最具代表性的成員之一，同時與神經(jīng)生長因子(NGF)有50%的同源性。BDNF由神經(jīng)元細胞分泌，在體內(nèi)以二聚體的形式存在，對神經(jīng)元的生存、分化、生長和維持神經(jīng)元的功能具有重要作用;而且在病理狀態(tài)下，能抵抗神經(jīng)元損傷，促進受損神經(jīng)元修復，維持神經(jīng)元的正常功效。BDNF能影響突觸遞質(zhì)的分泌，對中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛作用［4］。研究證實，BDNF與神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有著密切的關系。研究報道，糖尿病大鼠腦組織和坐骨神經(jīng)中的BDNFmRNA水平下降，同時研究發(fā)現(xiàn)與BDNF結合的TrKB受體和刺激BDNF產(chǎn)生的NGFmRNA在糖尿病大鼠中多明顯減少［5-6］。國外文獻報道，用外源性的BDNF治療糖尿病db/db小鼠能明顯減輕體質(zhì)量和降低血糖［7］。Tolwani等［8］研究證實，BDNF一類的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以通過增加雪旺細胞的增殖和遷移速度，來促進外周神經(jīng)髓鞘的形成。熊麗麗等［9］實驗發(fā)現(xiàn)，高糖條件下，周圍神經(jīng)組織中的BDNF蛋白表達下降，減弱了受損神經(jīng)纖維的修復能力。加味補肝湯可明顯上調(diào)內(nèi)源性BDNF蛋白的表達，其機制可能與營養(yǎng)神經(jīng)組織，從而改善神經(jīng)組織缺血缺氧和組織損傷有關，進而對DPN具有防治作用。

本實驗研究結果顯示，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)BDNF蛋白及BDNFmRNA表達均顯著下調(diào)，中藥糖痹康可顯著上調(diào)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)BDNF蛋白及BDNFmRNA表達。由此我們推測，臨床有效中藥糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)保護作用有可能與其上調(diào)大鼠坐骨神經(jīng)中 BDNF蛋白及BDNFmRNA表達有關。

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Effects of Chinese herbal compound Tangbikang on expression of BDNF protein and BDNFmRNA in sciatic nerve in diabetic rats

LCui-Yan1，2，ZHANG Sheng-Rong1，ZHAO Wen-jing1，CAI Zhen1，ZHENG Gui-min1，ZHAO Jing1，WANG Hui1，JIANG Yuan-yuan1，CHEN Yang-zi1，LIU Tong-Hua2△
(1．Department of Nephrology，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010;2．Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029)

Objective:To explore the effect of Chinese herbal compound Tangbikang on the expressions of BDNF protein and BDNF mRNA of diabetic rats'sciatic nerve．Methods:The experimental diabetes mellitus rats model were induced by feeding high fat forage and injection streptozotocin．Tangbikang groups were given Tangbikang with different dose，rats unilaterals sciatic nerve were cutting-up after 16 weeks，immunohistochemical method was used to detect the expressions of BDNF protein of sciatic nerve，and the expressions of BDNFmRNA were detected by semi-quantitative RTPCR，and compared with mecobalamine group．Results:The expressions of BDNF protein and BDNFmRNA of model group were significantly decreased compared with normal group，Tangbikang group significantly increased the expressions of BDNfprotein and BDNFmRNA．Conclusion:Chinese herbal compound Tangbikang could promote the expressions of BDNFprotein and BDNFmRNA of diabetic peripheral neuropathy rats’sciatic nerve

Tangbikang;Diabetes mellitus;Peripheral neuropathy;Sciatic nerve; Brain-derived neurotrophic factor

R871．6+4

B

1006-3250(2015)02-0168-04

2014-11-11

國家重大新藥創(chuàng)制項目(2012ZX09102201-001);教育部博士點基金立項課題(20110013130001);北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊項目(2011-CXTD-19);教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室資助項目;北京市中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室資助項目

呂翠巖，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)藥防治腎病、糖尿病及并發(fā)癥的臨床與作用機制研究。

△通訊作者:劉銅華，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導師，Tel: 010-64286642，E-mail:thliu@tom．com。