王雪芳，劉艷明

(1．河北北方學(xué)院，河北張家口 075000;2．中國人民解放軍251醫(yī)院心內(nèi)二科，河北張家口 075000)

氧化苦參堿對酸中毒兔右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響*

王雪芳1，劉艷明2

(1．河北北方學(xué)院，河北張家口 075000;2．中國人民解放軍251醫(yī)院心內(nèi)二科，河北張家口 075000)

目的:研究氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響及其對該部位自律性異常的調(diào)節(jié)作用。方法:玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄離體家兔右心室流出道自律細(xì)胞，觀察氧化苦參堿對右心室流出道細(xì)胞跨膜電位的影響，以及氧化苦參堿對模擬酸中毒條件(pH6.9)引發(fā)右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位各項(xiàng)指標(biāo)改變的影響。結(jié)果:在模擬酸中毒(pH6.9)灌流時，右室流出道細(xì)胞APD50、APD90均明顯縮短，VDD、Vmax和RPF顯著變慢;用不同劑量氧化苦參堿(25、50、100μmol/L)灌流，出現(xiàn)劑量依賴性APD50、APD90的延長，VDD與RPF進(jìn)一步減慢，以大劑量組氧化苦參堿影響作用最為明顯。結(jié)論:提示氧化苦參堿對酸中毒導(dǎo)致的家兔右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞跨膜電位改變所誘發(fā)的心律失常有明顯的保護(hù)作用。

氧化苦參堿;右心室流出道;酸中毒;跨膜電位

臨床研究發(fā)現(xiàn)，室性期前收縮和特發(fā)快速性室性心動過速的發(fā)生常與右心室流出道結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)，心室流出道曾被認(rèn)為僅是血液的流出通路。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳類動物心室流出道是由動脈球進(jìn)化而來，是位于心室后相對獨(dú)立的功能單位，具有獨(dú)立的跨膜電位特征［1］。酸堿失衡是導(dǎo)致心律失常發(fā)生的常見原因，機(jī)體酸中毒后心肌細(xì)胞往往出現(xiàn)繼發(fā)性缺血缺氧［2］，導(dǎo)致心室流出道細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)形態(tài)異常，從而誘發(fā)惡性心律失常。中藥苦參是豆科槐屬植物苦參的干燥根，其味苦、性寒，在《本草經(jīng)百種錄》中有“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經(jīng)之火”的記載，其對多種原因?qū)е碌男穆墒С＞辛己玫姆乐涡Ч?］。研究表明，氧化苦參堿是苦參的主要有效成分之一，具有一定的抗心律失常作用，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞內(nèi)玻璃微電極記錄手段，研究氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道自律細(xì)胞跨膜電位的影響作用，對臨床應(yīng)用氧化苦參堿治療心律失常，發(fā)掘中醫(yī)藥治療優(yōu)勢具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.5 ～2.0 kg家兔，雌雄均可，由中國醫(yī)科院動物研究所提供;氧化苦參堿購自寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號20070506);胺碘酮購自珠海潤都制藥股份有限公司(批號H20045108);配制臺式灌流溶液(KCl 4 mmol/L，NaCl 130 mmolL/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO40.5mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO320 mmolL/L，葡萄糖6 mmol/L，pH7.2)僅當(dāng)天使用。

1.2 主要儀器

RM-6280C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠生產(chǎn);DWF-3型微電極放大器，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn);SS-202J型隔離器，成都儀器廠生產(chǎn);SDQ-4型三道電子刺激器，蚌埠實(shí)用技術(shù)研究所生產(chǎn);上海精科雷磁pHS-3C酸度計。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備 家兔擊顱致昏，用開胸器在家兔4、5肋間迅速取出心臟，從主動脈用一次性注射器將臺式液快速注入，沖洗殘留血液。肺動脈后、右瓣之間切開動脈壁，向左下將右心室壁剪開，三瓣膜保留完整，向下取含右心室流出道部位長約4 mm組織。制好的右心室流出道標(biāo)本用大頭針固定灌流槽內(nèi)，用臺式液以15 ml/min進(jìn)行勻速灌流，灌流液充體積分?jǐn)?shù)為96%O2和4%CO2，溫度維持在(35± 0.5℃)。標(biāo)本在臺式液中穩(wěn)定20 min后實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 電位記錄和參數(shù)確定 玻璃微電極內(nèi)注入3 mol/L KCL充當(dāng)電極液。微電極緩慢固定于右心室流出道自律細(xì)胞內(nèi)，記錄動作電位，穩(wěn)定15 min開始實(shí)驗(yàn)。由玻璃微電極引導(dǎo)出動作電位，經(jīng)微電極放大器擴(kuò)大輸入計算機(jī)記錄，同時分析跨膜動作電位各項(xiàng)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)分為4組:正常對照組正常臺式液灌流;模型對照組用乳酸鈉調(diào)節(jié)酸度，酸度計測量至pH6.9灌流;對照藥物組造模同模型組，以胺碘酮(25 μmol/L)灌流;氧化苦參堿組造模同模型組，分別以小中大劑量氧化苦參堿(25、50、100 μmol/L)灌流。

觀察跨膜動作電位:復(fù)極50%和90%時間(50%and 90%of duration of action potential，APD50and APD90)，4相自動除極速率(velocity of diastolic depolarization，VDD)，自發(fā)放電頻率 (rateof pacemaker firing，RPF)，動作電位幅值(amplitude of action potential，APA)，0相最大除極速率(maximal rate of depolarization，Vmax)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)流程 玻璃微電極穩(wěn)定在右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞上15 min右右，記錄正常的跨膜電位，依次加入濃度不同的氧化苦參堿灌流液并記錄數(shù)據(jù)。用正常臺式灌流液沖洗20 min后，然后用模擬酸中毒臺式液(KCl 4 mmol/L，NaCl 130 mmolL/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO40.5 mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO312 mmol/L，乳酸鈉20 mmolL/L，pH6.9)、用乳酸鈉調(diào)節(jié)臺式液pH值達(dá)6.9(此值是在心肌缺血、梗死局部內(nèi)環(huán)境中常見的［2］)灌流，記錄參數(shù)變化;穩(wěn)定10 min后用胺碘酮(25 μmol/L)灌流，記錄跨膜電位各項(xiàng)參數(shù)變化;正常臺式灌流液沖洗20 min后，待各項(xiàng)參數(shù)基本恢復(fù);用乳酸鈉調(diào)節(jié)臺式液酸度，造模同模型組，依次用含有不同濃度氧化苦參堿的臺式液灌流(25、50、100 μmol/L)，記錄不同濃度氧化苦參堿對酸中毒家兔離體心肌細(xì)胞跨膜電位的影響。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，跨膜動作電位各觀察數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，給藥前后各項(xiàng)指標(biāo)采用自身配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道自律細(xì)胞跨膜電位的影響作用

表1顯示，右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞APD50、APD90明顯縮短(P＜0.05)，VDD變慢(P＜0.05);Vmax變快(P＜0.05);大劑量組RPF顯著變慢(P＜0.01)，具有明顯的劑量依賴性。

2.2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道自律細(xì)胞跨膜電位的影響

表2顯示，氧化苦參堿小劑量組與酸中毒對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);氧化苦參堿中等劑量組顯示，右室流出道細(xì)胞RPF進(jìn)一步變慢(P＜0.05);氧化苦參堿大劑量組顯示，右室流出道細(xì)胞APD50、APD90均明顯延長(P＜0.05)，RPF與酸中毒組比較顯著變慢(P＜0.01)。

表1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響作用(±s)

表1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響作用(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 家兔數(shù) APD50(ms) APD90(ms) VDD(mV/s) RPF(beats/min) APA(mV) Vmax(V/s)正 常 對 照 組 10 116.36±13.48 209.48±26.36 35.54±3.96 128.15±18.25 56.16±5.12 9.05±0.74氧化苦參堿組(25μmol/L) 10 116.32±14.74 199.54±18.34 33.56±4.68 112.79±11.46 51.57±6.46 9.46±0.77氧化苦參堿組(50μmol/L) 10 109.58±14.86 195.25±11.34 31.34±4.66 82.62±34.66* 50.65±5.78 9.43±0.58氧化苦參堿組(100μmol/L) 10 106.57±11.46*190.55±16.73* 29.56±3.44* 71.71±12.62＊＊49.67±5.29* 10.28±0.91*

表2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響作用(±s)

表2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道心肌細(xì)胞跨膜電位的影響作用(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與對照藥物組比較:△P＜0.05

組別 家兔數(shù) APD50(ms) APD90(ms) VDD(mV/s) RPF(beats/min) APA(mV) Vmax(V/s)正 常 對 照 組 10 118.63±15.29 216.13±35.34 34.66±4.46 126.29±20.22 51.66±6.37 8.93±1.04模 型對照組(pH 6.9) 10 96.47±11.58*188.23±31.47* 27.43±3.96* 101.34±17.13＊＊41.38±5.32* 6.02±0.87＊＊對照藥物組(25 μmol/L) 10 121.63±15.29#245.46±27.61# 24.68±3.58# 79.58±11.67## 47.63±4.55# 7.45±0.64#氧化苦參堿組(25μmol/L) 10 97.17±10.38 189.68±21.11 27.14±5.24 99.36±13.33 41.06±7.58 7.13±0.48氧化苦參堿組(50μmol/L) 10 99.59± 9.86 191.79±18.54 25.58±3.47 92.66±20.37#△44.25±4.89 7.69±0.53氧化苦參堿組(100μmol/L) 10 107.58±16.23#△205.23±32.23#△20.96±4.36#△ 87.26±17.23##△49.14±4.26#△ 7.99±0.42#△

3 討論

氧化苦參堿是中藥苦參的主要有效成分。國內(nèi)研究證明，氧化苦參堿具有明顯的抗心律失常作用［4］。中醫(yī)史典籍早有苦參“苦入心，寒除火”的記載，故苦參專治“心經(jīng)之火”。其機(jī)制可能與其影響鈉離子通道(INa)、抑制ATP敏感性鉀離子通道的活性與促進(jìn)電壓依賴性鈣離子通道的開放有關(guān)［5］。INa是影響心肌傳導(dǎo)性、舒張期去極化速率和興奮性的重要離子流。0相去極化是由Na+的快速內(nèi)流所形成，這種細(xì)胞膜電位的急劇變化在心室肌可觸發(fā)興奮的傳導(dǎo)和肌肉的收縮。氧化苦參堿可以顯著延長心肌有效不應(yīng)期，增加心肌細(xì)胞舒張期興奮閾值［6］。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死、心肌缺血局部環(huán)境出現(xiàn)酸中毒時細(xì)胞內(nèi)pH值下降和胞內(nèi)酸化。酸中毒的同時伴發(fā)心肌細(xì)胞明顯的電生理改變，細(xì)胞內(nèi)氧分壓降低，心肌細(xì)胞內(nèi)ATP逐漸耗竭，與此同時細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+的濃度增加，L型鈣離子通道開放時程縮短，閉合時間加長［7］。同時發(fā)現(xiàn)，右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞動作電位呈現(xiàn)多種形態(tài)，即具有明顯的電生理異質(zhì)性［8］。我室對右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞跨膜離子流基礎(chǔ)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其與竇房結(jié)起搏細(xì)胞類似，右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞跨膜動作電位0期去極化離子流主要為鈣離子內(nèi)流和少量鈉離子內(nèi)流，復(fù)極化過程中起主導(dǎo)作用的是外流的鉀離子，4期自動除極化主要是ICa-L參與和進(jìn)行性衰減的鉀離子外流存在［9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體電解質(zhì)紊亂、心肌細(xì)胞酸中毒缺氧以及藥物等因素均是心肌細(xì)胞發(fā)生電生理異質(zhì)性的誘發(fā)因素，同時可導(dǎo)致嚴(yán)重的特發(fā)性室性心律失常。而提高細(xì)胞舒張期興奮閾值，能降低心肌細(xì)胞自律性，減少觸發(fā)活動，延長有效不應(yīng)期，可使折返落入有效不應(yīng)期而終止心律失常［10-11］。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，用模擬酸中毒臺式液灌流家兔右心室流出道組織后VDD和RPF明顯減慢，并隨著時間的延長有心律不規(guī)則現(xiàn)象發(fā)生;用中等劑量氧化苦參堿灌流后顯示，右室流出道細(xì)胞RPF進(jìn)一步變慢;用氧化苦參堿大劑量組灌流后顯示，右室流出道細(xì)胞APD50、APD90均明顯延長，VDD、Vmax和RPF顯著變慢，且心律逐漸恢復(fù)正常，故此效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性。與對照組胺碘酮比較，RPF明顯加快。胺碘酮(amiodarone)是目前最常用的抗心律失常藥物之一，是心臟離子多通道阻滯劑。胺碘酮的電生理作用主要表現(xiàn)在抑制竇房結(jié)和房室交界區(qū)的自律性，減慢心房、房室結(jié)和房室旁路傳導(dǎo)，延長心房肌、心室肌的動作電位時程和有效不應(yīng)期，延長旁路前向和逆向有效不應(yīng)期。其對由心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的影響表現(xiàn)在RPF(P＜0.01)的變慢，與此同時可引起心動過緩、房室傳導(dǎo)阻滯等不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出氧化苦參堿可以干預(yù)由胺碘酮所引發(fā)的這種電生理反應(yīng)。酸中毒時，ATP敏感性鉀離子通道激活，同時抑制電壓依賴性的鈣離子通道，全細(xì)胞膜片鉗記錄If密度值明顯減?。?2］。因此，推測氧化苦參堿是通過影響ICa-L、抑制酸中毒后的鈣超負(fù)荷、減少動作電位平臺期鈣離子內(nèi)流、延長心肌細(xì)胞膜Na+-Ca2+的交換時間來發(fā)揮其作用的。APD的縮短是折返性心律失常發(fā)生的電生理表現(xiàn)之一［13］。本實(shí)驗(yàn)氧化苦參堿延長了酸中毒所導(dǎo)致的APD50、APD90的縮短，這種作用可能與其能在平臺期降低Ca2+的濃度、延長有效不應(yīng)期、降低異位節(jié)律發(fā)生率有關(guān)，從而顯示了其能抗折返性心律失常的效應(yīng)。

研究結(jié)果表明，氧化苦參堿能夠削減酸中毒對心肌細(xì)胞的損害作用，降低酸中毒后心律失常的發(fā)生率，促進(jìn)酸中毒后心臟正常生理功能的恢復(fù)，提示氧化苦參堿對酸中毒導(dǎo)致的右心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的異常電生理所致的心律失常有一定干預(yù)作用。同時本實(shí)驗(yàn)可為氧化苦參堿藥理機(jī)制研究和臨床心律失常中醫(yī)用藥治療打下了一定基礎(chǔ)。

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Effects of oxymatrine on the transmembrane potential of myocardial cells of right ventricle outflow tract with acidosis in rabbits

WANG Xue-fang1，LIU Yan-ming2
(1．Department of physiology Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China; 2．Department of CardiologyⅡThe Chinese People's Liberation Army 251 Hospital，Zhangjiakou 075000，China)

Objective:to observe the effects of Oxymatrine on isolated rabbits cardiac cells transmembrane potential induced by acidosis and anti-arrhythmic effects of the mechanism．Methods:By using conventional intracellular microelectrode technique to record transmembrane potential．Results:in simulation acidosis pH6.9 condition，right ventricular outflow tract cell APD50，APD90were significantly shortened，VDD、Vmax and RPF significantly slow;With different doses of Oxymatrine(25、50、100μmol/L)perfusion，appear dose dependence．APD50，APD90prolonged，VDD and RPF significantly more slower．Conclusion:the Oxymatrine to acidosis in rabbits right ventricular outflow tract slow reaction self-discipline cell transmembrane potential to change induced arrhythmia has a significant protective effect．

Oxymatrine;Right ventricular outflow tract;Acidosis; Transmembrane potential

R285．5

B

1006-3250(2015)02-0162-03

2014-11-02

河北省教育廳青年基金資助項(xiàng)目(SQ132004);河北北方學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(Q2013032)

王雪芳(1978-)，女，北京人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥對心血管保護(hù)作用及心臟電生理的臨床與研究。