李曉樓

（四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院 建筑與環(huán)境工程系，四川 遂寧 629000）

研究報(bào)告

MBR系統(tǒng)好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鑒定

李曉樓

（四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院 建筑與環(huán)境工程系，四川 遂寧 629000）

采用間歇曝氣法對(duì)MBR系統(tǒng)好氧反硝化菌進(jìn)行了培養(yǎng)和富集，考察了系統(tǒng)的好氧反硝化效果及其影響因素，并對(duì)好氧反硝化菌進(jìn)行了分離和鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在DO為2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）為8∶1的條件下，MBR系統(tǒng)好氧反硝化效果較好，COD、氨氮、TN的去除率分別達(dá)到90%，90%，62%左右；從系統(tǒng)活性污泥中得到11株好氧反硝化性能較好的好氧反硝化菌，它們屬于變形菌門，分別屬于不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和噬氫菌屬。

生物脫氮；膜生物反應(yīng)器；好氧反硝化菌；菌種鑒定

近年來，國(guó)家對(duì)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和水處理要求的提高，對(duì)生物脫氮技術(shù)的發(fā)展提出了更高要求。傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)存在較多不足之處，如硝化菌群增殖速度慢、需進(jìn)行污泥和硝化液的回流、系統(tǒng)抗沖擊能力較弱以及脫氮酸堿度需調(diào)節(jié)等［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，在好氧硝化池中常有超出微生物增殖所需的氮的去除，損失的總氮量高達(dá)30%［2］。這種好氧過程中的脫氮現(xiàn)象是由好氧反硝化菌引起的。與傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)相比，好氧反硝化菌脫氮具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）使硝化/反硝化反應(yīng)在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，可大幅減少占地面積和建設(shè)資金；2）可減少調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH的化學(xué)藥劑用量，降低成本；3）好氧反硝化菌在處理過程中更易控制［3］。

目前，在多種生物處理系統(tǒng)中都發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化過程的存在，如好氧曝氣池和SBR系統(tǒng)［4-5］。由于生長(zhǎng)條件和競(jìng)爭(zhēng)等因素限制，好氧反硝化菌不易篩選和富集，而采用生物固定化技術(shù)和MBR能夠有效地保留和富集好氧反硝化菌［6-7］。通過對(duì)生物處理系統(tǒng)中好氧反硝化菌的分離篩選和鑒定，了解系統(tǒng)中好氧反硝化菌的生長(zhǎng)條件，有利于調(diào)控生物處理系統(tǒng)，保證好氧反硝化過程的順利進(jìn)行［8-9］。同時(shí)，對(duì)好氧反硝化菌的分離篩選有助于強(qiáng)化生物脫氮過程［10］。

本工作采用間歇曝氣法對(duì)MBR系統(tǒng)好氧反硝化菌進(jìn)行了培養(yǎng)和富集，考察了系統(tǒng)的好氧反硝化效果及其影響因素，并對(duì)好氧反硝化菌進(jìn)行了分離和鑒定，以期為MBR系統(tǒng)好氧反硝化菌的培養(yǎng)及系統(tǒng)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

溴百里酚藍(lán)（BTB）分離培養(yǎng)基：KNO31 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eC120.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，丁二酸鈉8.5 g，1%（w）BTB無水乙醇溶液1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

反硝化培養(yǎng)基：KNO31 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eCl20.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸鈉4.5 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

微量元素溶液：乙二胺四乙酸5.0 g，CaCl20.5 g，ZnSO40.3 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CuSO4·5H2O 0.2 g，CoCl2·6H2O 0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH=6.0。

FM培養(yǎng)液：牛肉膏1.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

DM培養(yǎng)液：Na2HPO4·7H2O 7.9 g，KH2PO41.5 g，KNO30.3 g，微量元素溶液1 mL，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

廢水：人工配制的模擬廢水，主要成分為FM培養(yǎng)液2%（w）、DM培養(yǎng)液3%（w）、實(shí)際生活污水（取自四川省遂寧市某生活區(qū)）10%（φ）。廢水的水質(zhì)見表1，廢水pH控制在6.3～7.5。

活性污泥：取自四川省某污水處理廠污泥濃縮池的好氧污泥，呈絮狀，沉降性能良好。

DYCP-34A型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠；CARY300型紫外-可見分光光度計(jì)：美國(guó)Varina公司；HQ30d型便攜式溶氧儀：HACH公司；BS210S型電子天平：美國(guó)賽多利斯天平有限公司。

表1 廢水的水質(zhì) mg/L

1.2 MBR系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)

MBR：自制，采用聚偏氟乙烯（PVDF）纖維實(shí)驗(yàn)型膜片制成內(nèi)徑為20 cm、高度約120 cm的圓柱形玻璃容器，有效容積30 L。系統(tǒng)基本運(yùn)行參數(shù)：HRT=12 h，MLSS=6～8 g/L，SRT=20～30 d；DO控制在0.5～5.0 mg/L，通過控制曝氣量進(jìn)行調(diào)節(jié)；m（C）∶m（N）控制在（3～12）∶1，通過改變Na3C6H5O7·2H2O投加量進(jìn)行控制。MBR系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)見表2。

1.3 好氧反硝化菌的培養(yǎng)與富集

采用間歇曝氣法對(duì)MBR系統(tǒng)中好氧反硝化菌進(jìn)行培養(yǎng)和富集［11］。該方法利用好氧反硝化菌可同時(shí)將O2和NO3-作為電子受體的特性，將好氧、缺氧條件進(jìn)行轉(zhuǎn)換，能夠完全抑制好氧菌和厭氧菌的正常生長(zhǎng)，促使好氧反硝化菌在競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)地位。經(jīng)過30 d培養(yǎng)，系統(tǒng)在好氧條件下脫氮效果達(dá)到穩(wěn)定，TN去除率維持在30%～40%。

表2 MBR系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)

1.4 好氧反硝化菌的篩選

從MBR中取10 mL泥水混合液，與90 mL反硝化培養(yǎng)基混合，置于30 ℃搖床內(nèi)培養(yǎng)24 h。將活性污泥培養(yǎng)液按一定比例稀釋，取適量涂布于BTB分離培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。挑取使培養(yǎng)基顯色（藍(lán)色）的單菌落至BTB分離培養(yǎng)基上，經(jīng)5～6次劃線純化分離得純菌株，于4 ℃保存。

1.5 好氧反硝化菌的鑒定

采用Chelex法提取好氧反硝化菌DNA：取1 mL 37 ℃振蕩培養(yǎng)后的菌液于1.5 mL離心管中，以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min，去除上清液，加入1mL Trizol試劑，得DNA提取液。

參照文獻(xiàn)［12］報(bào)道的方法進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增引物序列為上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?9 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（共30個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至深圳華大基因研究院進(jìn)行16S rRNA基因序列的測(cè)定。參照文獻(xiàn)［13］報(bào)道的方法將16S rRNA基因序列（約700 bp）導(dǎo)入EzTaxon-e基因庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.6 分析方法

按照文獻(xiàn)［14］報(bào)道的方法進(jìn)行水質(zhì)的測(cè)定。其中，采用重鉻酸鉀法測(cè)定COD；采用納氏試劑光度法測(cè)定氨氮；采用過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法測(cè)定TN；采用便攜式溶解氧儀法測(cè)定DO；采用酚二磺酸光度法測(cè)定硝酸鹽氮；采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定亞硝酸鹽氮。

挑取篩選提純的菌落至LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液離心，用生理鹽水洗滌，分別挑取一環(huán)接種至100 mL反硝化培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。測(cè)定反應(yīng)前后培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算菌株的總脫氮率（η，%）。

η=［ρ（初始硝態(tài)氮）-ρ（反應(yīng)后硝態(tài)氮）-ρ（反應(yīng)后亞硝態(tài)氮）］/ρ（初始硝態(tài)氮）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 MBR系統(tǒng)的處理效果

MBR系統(tǒng)的處理效果見圖1。由圖1可見：在30 d的啟動(dòng)期中，COD去除率在前10 d逐漸增加，在11～30 d期間，微生物適應(yīng)進(jìn)水水質(zhì)后，COD去除率逐漸穩(wěn)定，基本維持在90%左右；氨氮去除率在前16 d內(nèi)總體呈上升趨勢(shì)，系統(tǒng)的硝化能力逐步加強(qiáng)，在馴化階段后期，氨氮去除率趨于穩(wěn)定，達(dá)到90%左右；TN去除率在馴化初期呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性，23 d后穩(wěn)定在40%左右，可認(rèn)為此時(shí)好氧反硝化菌落結(jié)構(gòu)已趨于穩(wěn)定。

圖1 MBR系統(tǒng)的處理效果

2.2 DO對(duì)好氧反硝化效果的影響

階段2考察了DO對(duì)MBR系統(tǒng)處理效果的影響。由圖1可見：當(dāng)DO為0.5～1.0 mg/L（31～37 d）時(shí)，由于DO的不足，造成系統(tǒng)COD、氨氮的去除效果及反硝化效果不佳；隨DO的增加，COD、氨氮的去除效果及反硝化效果逐漸提升；當(dāng)DO為2.0～3.0 mg/L（45～51 d）時(shí)，COD、氨氮的去除效果恢復(fù)至正常水平，同時(shí)反硝化效果達(dá)到最優(yōu)。

DO對(duì)MBR系統(tǒng)TN去除率的影響見圖2。

圖2 DO對(duì)MBR系統(tǒng)TN去除率的影響

由圖2可見：當(dāng)DO為0.5～1.0 mg/L時(shí)，好氧反硝化效果不佳，TN去除率維持在20%以下；隨DO的增加，好氧反硝化效率呈先增后降的趨勢(shì)；當(dāng)DO為2.0～3.0 mg/L時(shí)，好氧反硝化效率達(dá)到最高，TN去除率達(dá)40%；DO繼續(xù)增至3.0～5.0 mg/L時(shí)，TN降至34%。

綜上所述，DO對(duì)好氧反硝化效果影響較大。低DO條件下，細(xì)胞活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)率和反硝化率降低，硝酸鹽還原酶處于抑制狀態(tài)。此時(shí)，脫氮主要是通過傳統(tǒng)缺氧反硝化過程，有利于N2生成［15-16］。高DO條件下，微生物活性增加，聚β-羥基丁酸得以積累而利于快速脫氮，使得好氧反硝化順利進(jìn)行［17］。曝氣時(shí)間過長(zhǎng)，好氧反硝化菌體開始衰亡，數(shù)量減少，活性降低［18］，從而導(dǎo)致TN去除率出現(xiàn)下降。

2.3 有機(jī)碳源對(duì)好氧反硝化效果的影響

階段3考察了m（C）∶m（N）對(duì)MBR系統(tǒng)處理效果的影響。由圖1可見：隨m（C）∶m（N）的增大，COD、氨氮的去除效果未受明顯影響，去除率維持在90%左右；好氧反硝化效果隨m（C）∶m（N）的增大而逐漸提升，當(dāng)m（C）∶m（N）增至8∶1（69～74 d）時(shí)，好氧反硝化效果提升最為明顯。

m（C）∶m（N）對(duì)MBR系統(tǒng)TN去除率的影響見圖3。由圖3可見：好氧反硝化效果隨m（C）∶m（N）的增大而逐漸提升，當(dāng)m（C）∶m（N）增至8∶1時(shí)，好氧反硝化效率提高明顯，TN去除率達(dá)62%左右；m（C）∶m（N）繼續(xù)增至12∶1，好氧反硝化效率提高不明顯，TN去除率升至68%左右。

圖3 m（C）∶m（N）對(duì)MBR系統(tǒng)TN去除率的影響

綜上所述，有機(jī)碳源對(duì)好氧反硝化過程發(fā)揮著重要作用，且m（C）∶m（N）越大反硝化效果越好。這是因?yàn)椋撼渥愕奶荚茨軌驗(yàn)槲⑸锾峁┳銐虻哪芰浚狗聪趸饔酶鼜氐?；同時(shí)，硝酸鹽還原酶表達(dá)基因調(diào)控蛋白FNR對(duì)周圍電子供體和受體變化敏感，相對(duì)較高的m（C）∶m（N）激活了好氧反硝化菌相關(guān)反硝化基因的表達(dá)［19］；而低m（C）∶m（N）時(shí)，碳源快速消耗，碳源的不足造成反硝化過程受阻。

2.4 好氧反硝化菌群的鑒定結(jié)果

MBR系統(tǒng)經(jīng)長(zhǎng)期馴化后，活性污泥經(jīng)分離純化得到11株好氧反硝化性能較好的細(xì)菌，利用基因庫(kù)比對(duì)11株好氧反硝化細(xì)菌的16S rRNA基因序列，其中，有11個(gè)與已知物種相近的不同序列，且與已知物種序列的相似性達(dá)到98%以上，它們屬于變形菌門（Proteobacteria），分屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和噬氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）。本實(shí)驗(yàn)11條16S rRNA基因序列的GenBank登錄號(hào)為KF984303～KF984313。

11株細(xì)菌中，總脫氮率在60%以上的有8株。而一般微生物脫氮的最佳效果也僅為30%（總脫氮率），由此可見，從系統(tǒng)中分離出的好氧反硝化菌具有較好的好氧反硝化性能［20-21］。

李安峰等［7］的研究結(jié)果表明，在SBR和MBR系統(tǒng)中分離出的高性能好氧反硝化菌屬變形菌門，這與本研究的結(jié)果相符。這些好氧反硝化菌在屬和種水平上表現(xiàn)出豐富的多樣性，它們的存在使得MBR系統(tǒng)好氧反硝化效果得以維持和穩(wěn)定。同時(shí)，不同系統(tǒng)好氧反硝化菌群落結(jié)構(gòu)的差異性也為系統(tǒng)好氧反硝化提供了菌株資源。

3 結(jié)論

a）在DO為2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）為8∶1的條件下，MBR系統(tǒng)好氧反硝化效果較好，COD、氨氮、TN的去除率分別達(dá)到90%，90%，62%左右。

b）通過對(duì)系統(tǒng)活性污泥中好氧反硝化菌的分離和鑒定，得到11株好氧反硝化性能較好的好氧反硝化菌，它們屬于變形菌門，分屬于不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和噬氫菌屬。

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（編輯 魏京華）

Aerobic Denitrification Effect of MBR and Identification of Aerobic Denitrlfier

Li Xiaolou
（Architecture and Environmental Engineering Department，Sichuan Vocational and Technical College，Suining Sichuan 629000，China）

Aaerobic denitrlf i ers were cultivated and enriched in MBR system by the method of intermittent aeration. The aerobic denitrif i cation effect of MBR and the affecting factors were studied，and the aerobic denitrlf i ers were separated and identif i ed. The experimental results show that： When DO is 2.0-3.0 mg/L and m（C）∶m（N） is 8∶1，the aerobic denitrif i cation effect of MBR system is good，and the removal rates of COD，NH4+-N and TN are about 90%，90% and 62% respectively；11 strains of aerobic denitrlf i erwith good aerobic denitrif i cation capability are isolated from the MBR activated sludge，which belong to Proteobacteria and are Acinetobacter sp.，Comamonas sp.，Aeromonas sp.，Pseudomonas sp. and Hydrogenophaga sp.，respectively.

biological denitrif i cation；membrane bio-reactor；aerobic denitrlf i er；strain identif i cation

X703

A

1006-1878（2015）04-0339-05

2015 - 03 - 20；

2015 - 06 - 03。

李曉樓（1974—），男，四川省遂寧市人，碩士，副教授，電話 15244943011，電郵 lixiaolou_1234@163.com。