肖艷華，李艷艷，崔猛，龔煥

武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074

紅花中羥基紅花黃色素A的提取工藝

肖艷華，李艷艷，崔猛，龔煥

武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074

采用單因素實驗和4因素3水平正交實驗，利用面積歸一法，以高效液相檢測羥基紅花黃色素A的含量為指標，考察了羥基紅花黃色素A提取工藝的影響因素，確定了最佳的溶劑濃度、溶劑用量、提取溫度和超聲時間.結果表明超聲提取時間對羥基紅花黃色素A提取的影響最為顯著，影響因素的主次順序為:超聲時間＞乙醇濃度＞提取溫度＞溶劑用量.最佳單因素為:70%的乙醇質量濃度、50℃的提取溫度、體積比為15的溶劑用量、15 min的超聲時間；最佳提取工藝為:在50℃下，加入10倍量的質量分數(shù)70%乙醇，超聲提取20 min，固定提取次數(shù)為一次，此時羥基紅花黃色素A的提取含量最高.

羥基紅花黃色素A；正交實驗；超聲；提取工藝

0 引言

紅花（Safflower carthamus）為菊科植物的干燥管狀花.具有活血通經(jīng)，祛瘀止痛之功效，其藥花性濕、味辛微苦.紅花中含有紅色素和黃色素兩種色素［1］，其中羥基紅花黃色素A（HSYA）為紅花黃色素中藥效最好，而且含量最多的一種查爾酮苷類化合物，是紅花中最有效的水溶性成分［2］.研究表明，HSYA結構如圖1，可有效抑制血小板激活因子的誘發(fā)血小板聚集和釋放，可競爭性地抑制血小板激活因子與血小板受體的結合［3-8］，此外還用于保健品和化妝品中［9］.本實驗利用正交設計，采用L9（34）正交表以HSYA的含量為標準進行實驗，探討了HSYA的最佳提取條件，為紅花制劑的質量控制標準提供了科學依據(jù).

圖1 羥基紅花黃色素A的結構Fig.1 The structure of hydroxy safflower yellow A

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），JY5002電子天平（南京遠拓科學儀器有限公司），DHG-9143B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械有限公司），DIONEX，P680 HPLC Pump高效液相色譜儀（戴安公司），ZF-20D紫外可見分光光度計（鞏義予華儀器有限責任公司）.

所用藥材紅花樣品由湖北襄陽隆中藥業(yè)基團有限公司提供，經(jīng)隆中藥業(yè)肖作武總工鑒定，并保存于武漢工程大學化工與制藥學院制藥工程部實驗樓706室.實驗所用水為蒸餾水，高效液相所用試劑為色譜級，其它均為分析級.

1.2 質譜條件

鞘氣:45 unit／min，噴霧電壓:4．5 kV，加熱毛細管溫度:300℃，掃描方式:正離子掃描和負離子掃描，掃描質量范圍:50～2 000.

LC-MS分析結果:HSYA的液相色譜條件（面積歸一法）:甲醇:質量分數(shù)1．0%乙酸緩沖液＝3∶7，流速:1．0 mL·min-1，檢測波長:320 nm，柱溫:20℃，保留時間:t＝5．64 min.

1.3 紅花水提液的制備

精確稱量紅花藥材5g，按料液比100 mL·g-1加入蒸餾水，置于超聲容器中60 min，靜置12 h，過濾濃縮定容至50 mL，取2 mL再稀釋至50 mL作為分析用樣品.

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗取步驟1．3中供試液按1．2的色譜條件連續(xù)進樣6次，測得t＝5．64 min對應峰相對保留時間的RSD≤0．41%，相對峰面積RSD≤4．6%，可見儀器精密度良好.

1.4.2 重復性試驗精密稱取5 g樣品6份，按1．3的方法制得供試液，按1．2的色譜條件進樣測得t＝5．64 min對應峰相對保留時間的RSD≤0．35%，相對峰面積RSD≤3．4%，可見該方法重現(xiàn)性良好.

1.4.3 穩(wěn)定性試驗取1．3供試液，分別在0、2、4、8、12、16 h按1．2的色譜條件進樣，可測得t＝5．64 min對應峰相對保留時間RSD≤0．46%，相對峰面積RSD≤1．9%，說明樣品在16 h內穩(wěn)定.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇質量濃度的影響固定提取次數(shù)為一次，準確稱量2 g紅花藥材5等份，分別加入10倍（v／v）量的水，質量分數(shù)10%、40%、70%、95%乙醇，室溫條件下浸提60 min，抽濾、濃縮后加水定容至100mL，不同濃度乙醇提取后HSYA的含量分析結果見圖2.

圖2 不同乙醇質量分數(shù)對HSYA質量分數(shù)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of ethanol on the content of HSYA

由圖2可知，當乙醇質量分數(shù)達到70%，HSYA的提取已趨平衡.這個結果與HSYA的結構是相關的:HSYA是一個含有兩個單糖的雙糖查爾酮苷，結構中的12個羥基使該物質有一定的親水性，所以在查爾酮母核和糖的共同作用之下，HSYA既有一定的親水性，也有一定的親脂性，實驗表明，當乙醇質量分數(shù)為70%時，對HSYA的溶解度達到最高.

2.1.2 提取溫度的影響準確稱量2 g紅花藥材5等份，加入10倍（v／v）量的質量分數(shù)70%乙醇，提取時間為60 min，提取的溫度分別為20、30、40、50、60℃，抽濾、濃縮后加水定容至100 mL.不同溫度提取時HSYA的質量分數(shù)分析結果見圖3.

圖3 不同提取溫度對HSYA質量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on the content of HSYA

由圖3得，根據(jù)溶解原理，溫度高溶解度會增大，所以當提取溫度從20℃升至50℃時，HSYA的質量分數(shù)是越來越高，當溫度在50℃時達到最高.但是如果繼續(xù)提高提取溫度到60℃，發(fā)現(xiàn)其質量分數(shù)反而降低，這是因為HSYA結構中含有酚羥基、雙鍵和苷鍵等易于氧化、水合和水解的官能團，溫度持續(xù)的升高加大了HSYA形成醌、次生苷以及苷元的可能，使其含量急劇下降.通過此單因素實驗確定其最佳提取溫度是50℃.

2.1.3 溶劑用量的影響準確稱量2 g紅花藥材5等份，分別加入5、10、15、20、25倍（v／v）量的質量分數(shù)為70%乙醇，50℃下浸提60 min，抽濾、濃縮后加水定容至100 mL，不同溶劑用量提取后HSYA的質量分數(shù)分析結果見圖4.

圖4 不同溶劑用量對HSYA質量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of different amounts of solvent on the content of HSYA

由圖4可得，隨著溶劑用量的增加，HSYA的質量分數(shù)相應增大，說明增大溶劑用量有利于HSYA的充分提取.但是當紅花藥材和溶劑體積比到15、20和25倍時，HSYA的質量分數(shù)基本成了一條直線，繼續(xù)增加溶劑的用量，HSYA質量分數(shù)并沒有增加，說明體積比為15時提取已趨于完全，更多的提取溶劑只會增加后處理中蒸發(fā)溶劑的成本.

2.1.4 超聲提取時間的影響準確稱量2g紅花藥材5等份，加入15倍（v／v）量的質量分數(shù)為70%乙醇，室溫條件下分別超聲提取0、5、10、15、20min，再依次靜置浸提60、55、50、45、40 min，抽濾、濃縮后加水定容至100 mL.不同超聲時間提取后，分析HSYA的質量分數(shù)，結果見圖5.

由圖5可得，超聲提取15 min，HSYA質量分數(shù)達到最高，延長超聲時間HSYA含量下降，超聲雖能在空化效應的作用下使得植物細胞壁及整個生物體破裂，有利于有效成分的溶出，但長時間的空化效應不僅會使植物破裂，也會引入更多的雜質同時也使溫度升高，而高溫高壓都有可能加速查爾酮苷的水解最終使得HSYA的質量分數(shù)下降.

圖5 不同超聲時間對HSYA質量分數(shù)的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the content of HSYA

表1 L9(34)正交試驗的因素和水平Table 1 The factor and levels of orthogonal design

表2 正交試驗設計和結果Table 2 The orthogonal design and results

通過以上單因素實驗發(fā)現(xiàn)用15倍的質量分數(shù)為70%乙醇在50℃超聲提取15min，HSYA的質量分數(shù)達到最高.

2.2 正交實驗

通過上述單因素實驗結果，可以確定固定提取次數(shù)為一次的情況下，乙醇質量分數(shù)、溶劑用量、提取溫度及超聲時間對HSYA的提取有顯著影響.選擇乙醇質量分數(shù)（A）、溶劑量（B）、提取溫度（C）、超聲時間（D）四個因素考察，每因素各取3個水平，結合紅花藥材處理及對HSYA純化嘗試的實驗經(jīng)驗，安排L9（34）正交試驗表1.

3 結語

首先本實驗采用單因素實驗法，找出提取的最佳單因素點分別是:質量分數(shù)為70%的乙醇為最佳比例；50℃為提取最佳溫度；溶劑用量體積比為15時最佳；15 min為超聲最適時間.

然后以乙醇質量分數(shù)、溶劑用量、提取溫度、超聲時間為因素設計正交實驗，分析正交試驗結果可知，超聲提取對HSYA的提取影響最為顯著，影響因素的主次順序為超聲時間＞乙醇質量分數(shù)＞提取溫度＞溶劑用量.以高效液相檢測HSYA的質量分數(shù)為指標，超聲時間對HSYA的提取有顯著影響，超聲時間控制在一定范圍內，可充分提取HSYA；乙醇質量分數(shù)對HSYA的影響次之，保持一定質量分數(shù)的乙醇，可以使HSYA完全溶解，保持HSYA的提取質量分數(shù)較高；嚴格控制溫度，不僅可以提高HSYA的質量分數(shù)，還可以降低HSYA因受熱水解變性的可能性；溶劑量的影響較小，在保證紅花藥材充分浸泡的前提下，可以適當減少溶劑用量，這樣不僅降低了后處理的工作負荷，還降低了成本.本實驗最終確定HSYA的最佳提取工藝為A2B1C2D3，即50℃下，加入10倍量的質量分數(shù)70%乙醇超聲提取20 min效果最佳.

致謝

感謝武漢工程大學化工與制藥學院提供的試驗平臺，感謝本實驗室其他成員的幫助！

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Extraction process of hydroxy safflower yellow A in Safflower carthamus

XIAO Yan-hua，LI Yan-yan，CUI Meng，GONG Huan
School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

According to the content of hydroxy safflower yellow A（HSYA）by high performance liquid chromatography，single factor experiments and orthogonal experiments（four factors three levels）were conducted to determine the optimal factors on the extraction of HSYA，such as the concentration of solvent，the amount of solvent，extraction temperature and extraction time．The results show that the ultrasonic extraction time is the most important factor and the order of the influential factors are ultrasonic extraction time〉ethanol concentration〉extraction temperature〉solvent consumption．The conditions for the best single factor experiment are 70%ethanol concentration，15 times of the volume ratio of solvent and ultrasonic extract for 15 minutes under 50℃．The best extraction factor for the highest content of HSYA is adding 10 times of 70%ethanol extract only once for 20 minutes under 50℃with ultrasonic．

hydroxy safflower yellow A；orthogonal experiment；ultrasonic；extraction process

TB35

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.03.004

1674-2869（2015）03-0015-05

本文編輯：張瑞

2015-01-08

肖艷華（1971-），女，湖北武漢人，副教授，博士.研究方向:藥物合成及天然產(chǎn)物的提取分離與活性研究.