孫菲菲，李春雪，范桂枝

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

筋骨草屬（Aj uga）植物屬一年生、兩年生或多年生草本植物，約有40～50種［1］，在我國(guó)境內(nèi)，筋骨草屬植物主要有18種，主要分布在秦嶺的南部［2］。筋骨草是一種富含甾酮和生物堿等多種活性物質(zhì)的藥用植物，其生物活性物質(zhì)具有抗菌［3］、抗腫瘤［4］、抗HIV［5］等重要作用。目前，對(duì)筋骨草屬中植物源蛻皮激素的應(yīng)用研究主要集中在昆蟲(chóng)和醫(yī)藥領(lǐng)域。在昆蟲(chóng)上主要用于開(kāi)發(fā)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和植物源殺蟲(chóng)劑，其原理是干擾和破壞昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、影響蛻皮和使成蟲(chóng)不育［6－7］；在醫(yī)藥上發(fā)揮清熱解毒、涼血平肝的作用，治療肝炎、闌尾炎、乳腺炎、急性結(jié)膜炎、高血壓等，并已開(kāi)發(fā)出主治急、慢性支氣管炎的筋骨草膠囊［8－12］。因此，來(lái)源于筋骨草屬的植物源蛻皮激素必將逐步受到研究者的重視。

次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)現(xiàn)象是制約天然產(chǎn)物大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的核心問(wèn)題之一，理解和掌握次生代謝調(diào)控規(guī)律是解決這一問(wèn)題的基礎(chǔ)。雖然國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)次生代謝產(chǎn)物低產(chǎn)問(wèn)題進(jìn)行了研究，包括細(xì)胞系的優(yōu)選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)以及活性物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的克隆等［13－15］。但到目前為止，植物細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)問(wèn)題仍未得到很好解決。次生代謝產(chǎn)物的生物合成容易受外界因素的影響，而細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是介導(dǎo)外界因子誘發(fā)植物次生代謝產(chǎn)物合成的橋梁和紐帶［16］，因此尋找有效促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累的誘導(dǎo)子、并探討植物細(xì)胞中與次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，將有助于揭示植物次生代謝的調(diào)控機(jī)制，對(duì)解決植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物低產(chǎn)問(wèn)題具有重要的理論和實(shí)踐意義。

一氧化碳（Carbon Monoxide，CO）一直被人們視作有毒氣體，因其會(huì)與體內(nèi)血紅蛋白或某些酶類(lèi)的含鐵血紅素基團(tuán)結(jié)合引發(fā)機(jī)體中毒。直到上世紀(jì)90年代，隨著CO 生物學(xué)功能進(jìn)一步被揭示，CO 才開(kāi)始受到關(guān)注。最新研究表明，CO 也是一種重要的細(xì)胞信使分子，在細(xì)胞功能和通訊調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的信號(hào)作用。在植物中的研究發(fā)現(xiàn)，CO 具有促進(jìn)種子萌發(fā)和提高植物抗逆反應(yīng)等生理作用，同時(shí)對(duì)根的發(fā)生、氣孔運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞衰老進(jìn)行調(diào)節(jié)［17－18］。然而，CO 與次生代謝產(chǎn)物的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以產(chǎn)β－蛻皮甾酮的筋骨草愈傷組織為材料，首先從多花筋骨草（Aj uga multif lor a Bunge）和匐枝筋骨草（A．lobata）中篩選β－蛻皮甾酮含量高的品系進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，其次分析了CO 對(duì)β－蛻皮甾酮合成的調(diào)控作用。期望明確CO 與次生代謝產(chǎn)物的關(guān)系，找到同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的新誘導(dǎo)子，為解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的低產(chǎn)問(wèn)題提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 研究材料

多花筋骨草和匐枝筋骨草無(wú)菌組織培養(yǎng)植株均由東北林業(yè)大學(xué)森林生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。研究所用藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．2 研究方法

1．2．1 高產(chǎn)β－蛻皮甾酮愈傷組織的篩選 參照黎昕等［19］和馬欣等［20］的方法培養(yǎng)筋骨草的愈傷組織，使用MS 固體培養(yǎng)基，附加0．4 mg·L－12，4－dichlorophenoxyacetic acid（2，4－D），對(duì)多花筋骨草和匐枝筋骨草無(wú)菌組織培養(yǎng)植株根與葉片分別進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)期間繼代3次以獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的愈傷組織。將獲得的愈傷組織以1 g·瓶－1的接種量接種于100 mL MS固體培養(yǎng)基中，分別于第7、14、21和28天時(shí)以每皿為單位取樣進(jìn)行干重及β－蛻皮甾酮含量的測(cè)定，篩選最優(yōu)品系，組織培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間均為3次重復(fù)。

1．2．2 高產(chǎn)β－蛻皮甾酮愈傷組織懸浮體系的建立 將篩選獲得的優(yōu)良品系愈傷組織以8 g·瓶－1接種于100 mL MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞。分別在培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21和24 d以每瓶為單位取樣，測(cè)定干重及β－蛻皮甾酮含量，組織培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間均為3次重復(fù)。

1．2．3 外源CO 處理對(duì)懸浮細(xì)胞影響的研究 將懸浮細(xì)胞以鮮重12 g·瓶－1接種于100 mL MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到第8天時(shí)，添加CO 供體氯高鐵血紅素溶液，其終濃度分別為：20、16、12、8 和0 μmol·L－1。處理后于0．5、1、2、4和8 d分別取樣測(cè)定細(xì)胞干重及β－蛻皮甾酮含量，組織處理各濃度和時(shí)間均為3次重復(fù)。

1．2．4 β－蛻皮甾酮的提取及檢測(cè) 參照蔡曉明等［21］筋骨草甾醇提取法經(jīng)優(yōu)化獲得β－蛻皮甾酮的超聲微波醇提法：將筋骨草愈傷或懸浮細(xì)胞放入60℃烘箱至恒重，研磨成粉末狀，每個(gè)樣品準(zhǔn)確稱取0．2 g置于10 mL 離心管中，加入5 mL 色譜甲醇，超聲（10 k Hz）提取40 min，浸提過(guò)夜，再超聲（10 k Hz）提取40 min，在50 ℃、2 at m、300 W 的條件下微波消解提取10 min，過(guò)濾膜（0．45μm），待測(cè)。

參照張留記等［22］β－蛻皮甾酮高效液相色譜法并優(yōu)化色譜條件：色譜柱Hi Q sil C18 V 4．6 mm×250 mm，流動(dòng)相甲醇（甲醇∶水＝1∶1），檢測(cè)波長(zhǎng)242 n m，流速0．8 mL·min－1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積20μL。

以β－蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，在0．08～0．4 mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝2E－08 X－0．002 9（R2＝0．998 6）。

1．2．5 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)是3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，選用SPSS 19．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，選擇Duncan 法進(jìn)行多重比較，P＜0．05，利用Origin 8．0制圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 高產(chǎn)β－蛻皮甾酮的愈傷組織篩選

一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，多花筋骨草和匍枝筋骨草根、葉誘導(dǎo)的愈傷組織的干重積累量呈增加趨勢(shì)（圖1 A），且均在第28天達(dá)到最高值。研究發(fā)現(xiàn)，不同品種及部位的筋骨草愈傷組織在培養(yǎng)7 d時(shí)，干重?zé)o顯著差異（P＞0．05），而在14 d時(shí)，匐枝筋骨草根和葉誘導(dǎo)的愈傷組織干重均顯著高于多花筋骨草（P＜0．05），其中根的干重在第28天時(shí)最大，達(dá)到8．1 g·L－1。

匐枝筋骨草愈傷組織中β－蛻皮甾酮含量的變化趨勢(shì)與干重積累基本一致，而多花筋骨草愈傷組織中基本上檢測(cè)不到β－蛻皮甾酮（圖1B）。其中，匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的愈傷組織中β－蛻皮甾酮含量同樣在第28天時(shí)達(dá)到最大值（0．61 mg·g－1）。另外，愈傷組織培養(yǎng)到第7天，4種愈傷組織中均檢測(cè)不到β－蛻皮甾酮的積累，說(shuō)明愈傷組織生長(zhǎng)初期合成β－蛻皮甾酮的含量極低，高效液相水平?jīng)]有檢測(cè)到。

通過(guò)比較4種愈傷組織干重積累量及β－蛻皮甾酮含量的變化發(fā)現(xiàn)，匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的愈傷組織在干重和β－蛻皮甾酮含量上的積累均較高。因此，以下研究選用匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的愈傷組織作為研究材料。

2．2 高產(chǎn)β－蛻皮甾酮愈傷組織的懸浮培養(yǎng)

在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，愈傷組織懸浮細(xì)胞的干重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖2 A）。其中，在培養(yǎng)的12～15 d，干重積累顯著增加（P＜0．05）。由此可知，匐枝筋骨草懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)的12～15 d期間細(xì)胞生長(zhǎng)最快。同時(shí)，分析懸浮細(xì)胞中的β－蛻皮甾酮含量發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的9～15 d中，β－蛻皮甾酮含量迅速增加，在第15天時(shí)，β－蛻皮甾酮含量達(dá)到最大，為0．99 mg·g－1，

圖1 不同筋骨草組織誘導(dǎo)愈傷干重及β－蛻皮甾酮測(cè)定Fig．1 The deter mination of dry weight andβ－ecdysterone in different Aj uga lobata callus tissue

此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)β－蛻皮甾酮含量開(kāi)始逐漸下降，當(dāng)培養(yǎng)到第24天時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始褐化死亡，因此未測(cè)定β－蛻皮甾酮含量（圖2B）。

2．3 外源CO 處理對(duì)筋骨草懸浮細(xì)胞干重和β－蛻皮甾酮積累的影響

為了探究外源CO 處理對(duì)筋骨草懸浮細(xì)胞中β－蛻 皮 甾 酮 積 累 的 影 響，將8、12、16 和20 μmol·L－1的氯高鐵血紅素溶液分別處理培養(yǎng)8 d的懸浮細(xì)胞，分析其干重和β－蛻皮甾酮的積累量。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度及時(shí)間的處理，對(duì)細(xì)胞干重有著不同的影響，其中，8μmol·L－1處理8 d時(shí)，干重積累達(dá)最大值（圖3 A），為對(duì)照組的1．09倍。同時(shí)，過(guò)高的CO 濃度及過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間（20μmol·L－1，8 d）會(huì)對(duì)懸浮細(xì)胞的干重產(chǎn)生顯著抑制（P＜0．05）。外源CO 處理后懸浮細(xì)胞中β－蛻皮甾酮的積累量同樣發(fā)生變化，在處理第4天時(shí)，β－蛻皮甾酮含量較對(duì)照均顯著提高（P ＜0．05）（圖3 B）。其中，8 μmol·L－1處理時(shí)β－蛻皮甾酮含量為對(duì)照組的1．3倍，12μmol·L－1處理時(shí)為對(duì)照組的1．5倍。當(dāng)處理到第8天時(shí)，低濃度的CO 處理（8μmol·L－1）使β－蛻皮甾酮的積累量提高了80．82%，但其余高濃度處理的懸浮細(xì)胞中β－蛻皮甾酮含量顯著低于對(duì)照組（P＜0．05），分別比對(duì)照組降低了47．80%、66．00%和67．56%。因此，低濃度的氯高鐵血紅素溶液對(duì)懸浮細(xì)胞β－蛻皮甾酮的合成具有促進(jìn)作用，而過(guò)高的處理濃度及過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間對(duì)β－蛻皮甾酮的積累產(chǎn)生了抑制作用。

圖2 匐枝筋骨草根誘導(dǎo)愈傷組織懸浮細(xì)胞干重及β－蛻皮甾酮測(cè)定Fig．2 The deter mination of dry weight and β－ecdysterone in Aj uga lobata suspension cells

3 討論

圖3 不同濃度氯高鐵血紅素處理匐枝筋骨草根懸浮細(xì)胞干重及β－蛻皮甾酮含量Fig．3 The deter mination of dry weight andβ－ecdyster one in Aj uga lobata suspension cells treated with different concentrations of hemin

外植體是影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素之一，各種外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的難易與本身的生理生化狀態(tài)密切相關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中次生代謝物種類(lèi)和含量也不同，例如虎杖（Pol ygonu m cuspidatum）愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)莖段比葉片和葉柄誘導(dǎo)效率高且次生代謝物大黃素含量也較高［23］。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，多花筋骨草和匐枝筋骨草根和葉誘導(dǎo)愈傷組織中β－蛻皮甾酮積累量也不同，其中匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的愈傷組織在干重和β－蛻皮甾酮含量上的積累均較高。對(duì)于β－蛻皮甾酮含量較高的露水草（Cyanotis ar achnoides）植株根中β－蛻皮甾酮含量較高，通常在2．08%～3．10%，地上部分的含量則均在1．0%以下［24］，這與本研究結(jié)論相同。β－蛻皮甾酮的積累具有組織特異性，這可能與其功能存在著密切的聯(lián)系。β－蛻皮甾酮具有類(lèi)似植物激素的生物活性，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)侵害［15］，因此其在根中的高含量可能與保護(hù)植株有關(guān)，但其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

為了探究外源CO 處理對(duì)β－蛻皮甾酮含量積累的作用，本研究將不同濃度的CO 供體氯高鐵血紅素溶液添加到匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的懸浮培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)低濃度（8μmol·L－1）外源CO 促進(jìn)了β－蛻皮甾酮的積累量，而高濃度外源CO 及過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間（16及20μmol·L－1，8 d）對(duì)匐枝筋骨草懸浮細(xì)胞干重及β－蛻皮甾酮含量的積累產(chǎn)生了明顯的抑制作用。有研究表明，氣體信號(hào)分子對(duì)植物的影響具有雙重性，過(guò)高的氣體信號(hào)分子濃度會(huì)引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成細(xì)胞損傷［25］，這可能是引起β－蛻皮甾酮含量降低的一個(gè)重要因素。

β－蛻皮甾酮等次生代謝產(chǎn)物是植物長(zhǎng)期演化中形成的一種對(duì)環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，構(gòu)成了植物防衛(wèi)和抗逆系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。目前，氣體信號(hào)分子NO 調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物中的信號(hào)功能已被證實(shí)［26］，而新型信號(hào)分子CO 與次生代謝產(chǎn)物的關(guān)系本研究才初步證實(shí)，證明CO 可以促進(jìn)次生代謝物的積累，而其調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的機(jī)制還不清楚，這也是下一步研究的主要內(nèi)容。

4 結(jié)論

通過(guò)分析多花筋骨草和匐枝筋骨草根和葉誘導(dǎo)愈傷組織中β－蛻皮甾酮的含量，發(fā)現(xiàn)匐枝筋骨草根誘導(dǎo)的愈傷組織中β－蛻皮甾酮積累量最高。并對(duì)其進(jìn)行外源CO 處理結(jié)果顯示，低濃度（8μmol·L－1）外源CO 處理促進(jìn)了β－蛻皮甾酮的積累量，而過(guò)高濃度及過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間（16及20μmol·L－1，8 d）卻產(chǎn)生抑制作用。

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