閆秀梅，閆景彬，黃愛芬，黃開宇

(溫州醫(yī)科大學附屬育英兒童醫(yī)院消化內科，溫州 325000)

食物過敏在全球的發(fā)病率逐年上升，嚴重影響兒童生活質量[1]。研究表明，兒童食物過敏發(fā)病率為4%～6%。流行病學資料顯示，從2003到2013年18歲以下兒童食物過敏發(fā)生率增加了18%[2]。然而，目前尚無食物過敏的特效療法。由于倫理學限制和嚴重過敏反應，使人類食物過敏的研究受到限制。所以，利用食物過敏原建立動物食物過敏模型尋求新的預防和治療措施是最為常用的研究方法。目前，國際上尚無統(tǒng)一的食物過敏動物模型建立方法，本研究探討SD大鼠食物過敏動物模型的適宜條件及該模型消化系統(tǒng)超微結構的改變，探索理想的動物模型，以期為食物過敏的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

實驗動物

清潔級4周齡斷乳SD幼鼠30只，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗動物在溫州醫(yī)科大學實驗動物中心以不含卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的標準飼料及滅菌雙蒸水適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度23℃±3℃，濕度50%～70%，體質量60～80 g。鼠籠每周清洗消毒2次，采用12 h：12 h自動晝夜循環(huán)。

分組及模型建立

將30只實驗動物稱量并記錄各自體重，隨機編取30個數(shù)字，取其中20只為食物過敏組，10只為對照組。食物過敏組：第1天以含OVA 40 μg和氫氧化鋁31 mg的無菌生理鹽水0.5 ml溶液腹腔注射進行基礎致敏；第15天腹腔注射含OVA 40 μg的無菌生理鹽水0.5 ml進行強化致敏；第20天起以OVA生理鹽水溶液0.5 ml(OVA含量為30 mg)行隔日灌胃激發(fā)直至第49天。對照組：等量生理鹽水進行腹腔注射及灌胃。以腹瀉為造模成功標志。

血清OVA-IgE檢測

腹腔注射第1天記為第0天，分別于1、2、3、4、5、6、7周從大鼠尾靜脈取血1次，每次約0.5 ml，將其室溫靜置30 min后離心，獲得血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清OVA-IgE抗體水平。具體步驟參照說明書。

腸組織病理學檢測及超微結構觀察

實驗第49天麻醉大鼠，取其十二指腸Treitz韌帶以下5 cm小腸標本，一段放于中性甲醛固定液中并以石蠟包埋和切片，一塊(1 mm×1 mm×1 mm)放于電鏡液中(溫州醫(yī)科大學電鏡室提供)以進行光鏡與電鏡標本組織形態(tài)學觀察。隨機連續(xù)計數(shù)每個腸組織玻片高倍視野內腸黏膜嗜酸粒細胞(eosinophils，EOS)數(shù)目，累計10個高倍視野內EOS總數(shù)，取平均值作為EOS密度。甲苯胺藍特殊染色后進行肥大細胞計數(shù)，隨機連續(xù)計數(shù)每個腸組織玻片10個高倍視野內MC數(shù)，取平均值代表其密度(個/HPF)；累計10個高倍視野內MC總數(shù)及脫顆粒MC數(shù)，計算MC完整性百分率，公式為MC完整性百分率=[(肥大細胞總數(shù)-脫顆粒肥大細胞數(shù))/肥大細胞總數(shù)]×100%。電鏡下觀察小腸黏膜層絨毛、線粒體、內質網(wǎng)及緊密連接改變。

統(tǒng)計學分析

運用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析，采用重復測量資料的方差分析方法分析抗體含量組間差別、時間變化趨勢及組別和時間的交互作用。采用多元方差分析方法分析不同時間點組間差異。計量資料用均數(shù)±標準差表示。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

一般情況

食物過敏組表現(xiàn)為狂躁不安、易激惹。灌胃30 min后觀察大鼠腹瀉情況，20%食物過敏組動物在灌胃激發(fā)后3次出現(xiàn)腹瀉，40%在第4次出現(xiàn)腹瀉，>90%在第7次發(fā)生腹瀉，第10次所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉。

血清OVA-sIgE檢測結果

食物過敏組OVA-IgE水平在第4～6逐漸升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。食物過敏組OVA-IgE水平在第7周下降，與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表1)。

腸黏膜EOS密度比較和組織形態(tài)學改變

與對照組(n=5)相比，食物過敏組(n=10)腸黏膜EOS密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義[(1.70±0.42)個/HPFvs. (16.48±2.32)個/HPF，P=0.001]。光鏡下可見食物過敏組動物腸黏膜明顯損傷，小腸絨毛破壞、腫脹、脫落且明顯減少。對照組腸黏膜形態(tài)完整，腸絨毛排列整齊，組織結構清晰完整(圖1)。

腸黏膜組織肥大細胞密度和完整性百分率

對照組腸黏膜固有層僅能看到極少量肥大細胞，結構完整，輪廓清晰，無聚集、脫顆粒現(xiàn)象；食物過敏組腸黏膜固有層可見較多肥大細胞聚集，伴胞膜破裂，輪廓不清，并向外排出紫紅色顆粒(圖2)。

食物過敏組(n=10)和對照組(n=5)腸黏膜肥大細胞總數(shù)分別為(9.02±1.55)個/HPF和(1.84±0.87)個/HPF，完整性百分率分別為(36.50%±12.54%)和(92.20%±6.87%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

腸黏膜層電鏡超微結構改變

與對照組相比，食物過敏組電鏡下腸黏膜層小腸絨毛排列紊亂，甚至脫落，線粒體、內質網(wǎng)腫脹，細胞連接增寬(圖2)。

討　　論

目前，國內外已發(fā)表較多關于OVA致食物過敏動物模型的報道，但建模所選取的動物種類不一，建模方式也各有不同，建模標準尚未統(tǒng)一。模型較多采用小鼠致敏模型[3- 4]，包括C3H/HeJ、BALB/c、C57/BL6和DBA/2小鼠等，主要是因為體積小，繁殖周期短，容易處理，通常不受遺傳基因影響；且易產(chǎn)生高IgE和高IgG可用作研究食物過敏；然而，連續(xù)間斷性收集血液標本則較難達到。也有學者采用BN大鼠建立食物過敏動物模型[5]，BN大鼠食物過敏模型的優(yōu)點是動物大小適中，易連續(xù)采血觀察血清特異性IgE和IgG。de Jonge等[6]分別給不同品系鼠口服雞OVA6周，結果只有BN鼠能產(chǎn)生高水平的OVA特異性IgE抗體。但也有研究表明，BN鼠在新生期經(jīng)口腔給予OVA，斷乳后再灌胃或腹腔注射OVA均不能誘導過敏反應[7]。所以，為增加BN鼠口服致敏的敏感性和避免交叉反應，需要至少連續(xù)兩代用不含所研究蛋白或同種其他蛋白的特制飼料喂養(yǎng)。本研究選擇實驗動物為SD大鼠，SD大鼠屬于遠交系封閉群，生長快，繁殖周期短，抗病力強，容易飼養(yǎng)，價格較BN鼠便宜。與BALB/c小鼠相比，SD大鼠可間斷收集血液標本，是我國比較常用的實驗動物之一。本研究結果顯示，應用SD大鼠建立食物過敏動物模型，其所有大鼠均發(fā)生腹瀉，IgE明顯升高，小腸超微結構發(fā)生改變，表明可應用SD大鼠建立食物過敏模型。

表1　兩組SD大鼠不同實驗時間血清卵清蛋白-IgE含量變化

與對照組比較，*P<0.01

誘導食物過敏有多種途徑，包括口服給藥、腹腔注射、灌胃給藥和皮下注射等。不同鼠類種系致敏途徑不同。有研究應用BALB/c小鼠研究不同給藥途徑致敏情況，5周齡雄性BALB/c小鼠第1天腹腔注射OVA(50 μg)，2周后再次腹腔注射OVA(50 μg)，同時應用氫氧化鋁為佐劑，2周后每隔1 d灌胃口服OVA(50 mg)，小鼠腹瀉持續(xù)1 h，連續(xù)6個月，而為進行腹腔注射的小鼠未發(fā)生腹瀉；該研究者認為，可能與未經(jīng)過腹腔注射致敏小鼠容易發(fā)生口服耐受有關[8]。也有研究表明，佐劑如氫氧化鋁等預處理可預防口服耐受。Golias等[9]研究了2個月齡雌性BALB/c小鼠，分別于第1和14天腹腔注射OVA 60 μg和1 mg氫氧化鋁，2周后每2～3 d灌胃1次15 mg OVA，共10次，灌胃30 min后觀察腹瀉情況；第5次灌胃后70%小鼠發(fā)生腹瀉，第7次超過90%小鼠發(fā)生腹瀉，第10次100%發(fā)生腹瀉，本研究結果與之相似。本研究為造模成功，同樣使用氫氧化鋁佐劑與腹腔注射基礎致敏，結果示所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉，提示低劑量基礎致敏(加佐劑)與高劑量灌胃激發(fā)可成功造模。

Chen等[10]研究了劑量、致敏時間與IgE的相關性，分別給予6～8周齡BALB/c小鼠腹腔注射5、0.05、0.5 mg OVA，致敏次數(shù)分別為2次(第0和3天)和5次(第0、3、6、9和12天)，并檢測IgE水平；結果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射0.05 mg OVA，激發(fā)5次會產(chǎn)生較高水平IgE且更易致敏，第28天IgE水平較高。Atkinson和Miller[11]給予BN大鼠口服OVA 0.5～6.25 mg/100 g，2次/周，持續(xù)6周；第21天給予OVA 2.5 mg/100 g后BN大鼠均出現(xiàn)IgG升高，且該水平在第28天達到高峰；高劑量組(5 mg/100 g～6.25 mg/100 g)IgE水平在第14天即可測出，而低劑量組在第28天才可測出。Kostadinova等[12]通過BN大鼠研究了食物過敏模型，該研究規(guī)定了OVA劑量(0.002～20 mg/ml)、激發(fā)途徑(口服或灌胃)和激發(fā)次數(shù)(每天，2次/周，1次/周，每2周1次)等3個主要條件，持續(xù)6周；結果發(fā)現(xiàn)，每天灌胃1 mg OVA，在第28和42天可檢測特異性IgE，口服0.002、0.02和0.2 mg OVA均未產(chǎn)生特異性抗體；口服2 mg和20 mg OVA可產(chǎn)生IgG抗體，但未產(chǎn)生IgE抗體；該實驗表明，給藥途徑和劑量均可影響免疫反應。本實驗參照國外文獻[8]，致敏時間至49 d，首先腹腔注射基礎致敏及強化致敏，同時應用佐劑，然后大劑量隔日灌胃激發(fā)；結果發(fā)現(xiàn)，所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉，且EOS和肥大細胞計數(shù)均明顯升高，小腸超微結構發(fā)生明顯改變。

食物過敏模型的研究已取得了很大進展，但是國際上仍未有統(tǒng)一標準模型。本研究采用致敏原OVA與免疫佐劑氫氧化鋁，通過低劑量OVA腹腔注射致敏聯(lián)合高劑量OVA灌胃激發(fā)成功建立了SD大鼠食物過敏模型。

(本文圖1、2見封三)

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