蘭蓉，李雙石，辛秀蘭

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

葡萄糖氧化酶對(duì)藍(lán)莓酒貯藏過(guò)程中香氣成分的影響

蘭蓉，李雙石，辛秀蘭*

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

以樹(shù)莓酒為試材，分別以3種方式（葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理、葡萄糖氧化酶單獨(dú)處理、葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理）處理，以無(wú)菌蒸餾水處理為對(duì)照，4℃下貯藏6個(gè)月后，采用頂空固相微萃?。⊿PME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析了藍(lán)莓酒香氣成分的變化。結(jié)果表明：3種不同方式處理的藍(lán)莓酒，在香氣物質(zhì)總量、酯類成分含量、對(duì)果酒香氣質(zhì)量呈正向貢獻(xiàn)的典型香氣成分的保持效果方面均優(yōu)于對(duì)照組，其中葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒保持效果最好，更有益于藍(lán)莓酒的貯藏。

葡萄糖氧化酶；藍(lán)莓酒；香氣成分；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）

藍(lán)莓（Semen Trigonellae）屬于杜鵑花科越橘屬，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹(shù)種。藍(lán)莓果實(shí)含有花青素、黃酮等多種多酚類生理活性成分，使藍(lán)莓果實(shí)具有很強(qiáng)的抗氧化性，具有促視紅素再合成、改善循環(huán)、抗?jié)?、抗炎癥、提高免疫力、增強(qiáng)心臟功能、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌及抗突變等多種生理活性功能。因此，國(guó)際糧農(nóng)組織將其列為人類五大健康食品之一[1]。近年來(lái)，大量學(xué)者對(duì)藍(lán)莓酒的研制和有效成分分析做了諸多研究[2-5]，對(duì)藍(lán)莓果酒香氣成分的研究也有少量的研究報(bào)道[6]，但對(duì)藍(lán)莓酒貯藏過(guò)程中香氣成分的變化和改良至今少見(jiàn)有研究報(bào)道。

果酒是一個(gè)復(fù)雜的體系，在貯藏過(guò)程中其香氣成分受酒中成分和貯藏條件等因素的影響可能會(huì)發(fā)生許多復(fù)雜的化學(xué)變化。其中氧氣是導(dǎo)致果酒在貯藏過(guò)程中風(fēng)味發(fā)生顯著改變的主要原因之一，氧的存在不會(huì)促進(jìn)陳釀，反而會(huì)使氧化還原電位升高，并引起早熟，產(chǎn)生氧化味[7]。

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，簡(jiǎn)稱GOD）是一種天然的食品添加劑，對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)副作用，它能夠利用氧氣將葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效除氧，因而可作為生物去氧劑應(yīng)用于酒類產(chǎn)品的風(fēng)味改良[8-11]。本論文采用頂空固相微萃?。⊿PME）結(jié)合氣相質(zhì)譜（GCMS）檢測(cè)分析葡萄糖氧化酶對(duì)藍(lán)莓果酒貯藏過(guò)程中香氣物質(zhì)組成的影響，探討葡萄糖氧化酶對(duì)保持藍(lán)莓酒香氣及延長(zhǎng)保存期的作用，為藍(lán)莓酒的科學(xué)貯藏提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)，這方面的研究未見(jiàn)有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓酒：伊春市忠芝大山王酒業(yè)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖氧化酶：2 000U/g，北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫酶：20萬(wàn)U/mL，棗莊市杰諾生物酶有限公司；焦亞硫酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：分析純，天津市華東試劑廠。

1.2 設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀：7890A氣相色譜儀、5975質(zhì)譜儀，Agilent公司；手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器及100μm PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓酒貯藏前處理

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組別各取藍(lán)莓酒樣150m L進(jìn)行處理，具體處理方式見(jiàn)表1。對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組4℃貯藏6個(gè)月后取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 藍(lán)莓酒香氣成分的頂空固相微萃取

量取藍(lán)莓酒樣品15mL置于25mL頂空瓶中，加入2 gNaCl，加蓋密封，于45℃水浴中平衡10min；然后將在氣相色譜儀的進(jìn)樣口250℃老化1 h后的固相微萃取器插在頂空瓶上，吸附40min后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250℃解析5min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS分析條件

1.3.3.1 氣相色譜條件

DB-Wax彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm× 0.25μm）；程序升溫：初始溫度60℃，保持5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口250℃；傳輸線250℃；載氣：高純He（99.999%）；載氣流速1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式EI，70 eV；離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍30 amu～500 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)莓酒香氣成分的GC-MS分析

采用頂空固相微萃取（SPME）結(jié)合氣相質(zhì)譜（GCMS）檢測(cè)分析了藍(lán)莓原酒和采用3種不同方式處理并貯藏6個(gè)月的藍(lán)莓酒香氣成分，通過(guò)GC-MS自帶的NIST08.L庫(kù)自動(dòng)檢索獲得目標(biāo)組分的初步鑒定結(jié)果，再結(jié)合相關(guān)專業(yè)知識(shí)和有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行人工譜圖解析，最終確定各組分的化學(xué)名稱，采用峰面積歸一法對(duì)各組分進(jìn)行定量分析，分析鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，藍(lán)莓原酒中共檢測(cè)出40種香氣成分，占總峰面積的97.96%。其中，酯類20種，醇類2種，醛酮類3種，萜烯類5種，烷類4種，萘類4種，其它類2種，分別占香氣總量的64.98%、9.89%、10.61%、5.04%、1.3%、3.31%、2.83%。其中檸檬烯為藍(lán)莓原酒中獨(dú)有的香氣成分，在3種貯藏半年的藍(lán)莓酒中均有未檢出。有研究認(rèn)為檸檬烯含量下降，主要是由于在酸性條件下部分檸檬烯通過(guò)水合、水解等反應(yīng)生成α-、β-松油醇[12]。

對(duì)照組的藍(lán)莓酒貯藏半年后共檢測(cè)出40種香氣成分，占總峰面積的84.69%，與其他3種處理過(guò)的藍(lán)莓酒相比，香氣物質(zhì)總含量最低。其中，酯類18種，醇類4種，醛酮類4種，萜烯類4種，烷類4種，萘類4種，其它類2種，分別占香氣總量的56.54%、8.68%、8.93%、2.11%、2.46%、3.17%、2.8%。與原酒相比，不加酶處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后香氣物質(zhì)總量降低了13.27%，其中酯類成分含量下降了8.44%。李建東[13]研究報(bào)道，酒中溶解氧是影響酯水解速度的關(guān)鍵性因素，溶解氧加快了酒內(nèi)酯類的水解速度，從而導(dǎo)致了酯類成分含量的下降，降低了成品酒的品質(zhì)。

葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒

貯藏半年后共檢測(cè)出43種香氣成分，占總峰面積的94.76%，與其他3種處理藍(lán)莓酒的方法相比，香氣物質(zhì)種類和總含量最高。其中，酯類20種，醇類4種，醛酮類4種，萜烯類4種，烷類4種，萘類4種，其它類3種，分別占香氣總量的69.18%、8.3%、8.26%、3.50%、1.47%、1.75%、2.3%。與原酒相比，香氣物質(zhì)總量?jī)H降低了3.2%，而酯類成分含量卻增加了4.2%。上述結(jié)果與葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶的作用機(jī)理有關(guān)。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)消耗氧生成過(guò)氧化氫，而產(chǎn)生的過(guò)氧化氫是強(qiáng)氧化劑，能使酒中不飽和脂肪酸、酚類物質(zhì)、高級(jí)醇等香氣物質(zhì)在酒的貯存過(guò)程中發(fā)生氧化和降解，產(chǎn)生羰基化合物和揮發(fā)性醛類化合物，造成酒風(fēng)味的老化。而當(dāng)使用葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化氫酶的復(fù)合酶時(shí)，加入的過(guò)氧化氫酶能夠?qū)⑵咸烟茄趸冈谘趸^(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解生成水和1/2氧，而后水又與葡萄糖酸內(nèi)酯結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸，該反應(yīng)直到葡萄糖或氧消耗盡而終止，從而保護(hù)酒中易被氧化的物質(zhì)，同時(shí)由于降低了酒中的氧的濃度，抑制了酯類等香氣成分的降解[10]。

葡萄糖氧化酶單獨(dú)處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后共檢測(cè)出41種香氣成分，占總峰面積的86.69%。其中，酯類19種，醇類3種，醛酮類3種，萜烯類4種，烷類4種，萘類5種，其它類3種，分別占香氣總量的58.92%、8.04%、9.03%、2.12%、2.62%、2.98%、2.98%。與原酒相比，香氣物質(zhì)總量降低了11.27%，其中酯類成分含量下降了6.06%。原因如前所述，就是盡管利用葡萄糖氧化酶，可以有效地除去酒中的溶氧，但是同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫是產(chǎn)生羥基自由基的前體物質(zhì)，容易造成一些香氣成分的降解和氧化，這可能就是為什么用葡萄糖氧化酶單獨(dú)處理藍(lán)莓酒后，沒(méi)有較好的保持藍(lán)莓酒香氣成分的原因之一。

葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后共檢測(cè)出40種香氣成分，占總峰面積的89.58%。其中，酯類19種，醇類4種，醛酮類4種，萜烯類2種，烷類4種，萘類4種，其它類3種，分別占香氣總量的60.71%、6.6%、10.4%、2.34%、2.74%、3.16%、3.63%。與原酒相比，香氣物質(zhì)總量降低了8.65%，其中酯類成分含量下降了4.27%。亞硫酸鹽產(chǎn)生的二氧化硫具有去除自由基的作用，可以改善葡萄糖氧化酶脫氧所造成的缺陷[10]。黃惠芝等[11]的試驗(yàn)證明，葡萄糖氧化酶與亞硫酸鹽聯(lián)合使用，去氧效果更好。因此，加葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后，酯類成分總量的下降低于只加葡萄糖氧化酶處理的藍(lán)莓酒。但加葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒在香氣成分總量、種類和酯類物質(zhì)總量的保持上，效果不如加葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒，可能是由于過(guò)氧化氫酶能專一性的分解過(guò)氧化氫，從而更好地保護(hù)酒中的香氣成分。

2.2 藍(lán)莓酒貯藏期間典型香氣成分的分析

酯類物質(zhì)可以產(chǎn)生明顯的香氣。果酒在品嘗時(shí)，幾乎所有的香氣都是由酯類物質(zhì)產(chǎn)生的[14]。本研究中，酯類物質(zhì)是藍(lán)莓酒中組成種類最多且含量最高的物質(zhì)。5個(gè)藍(lán)莓酒樣品中平均含量最高的酯類都是丁二酸二乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯。丁二酸二乙酯具有淡而舒適的葡萄香氣；辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣；癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣；己酸乙酯具有強(qiáng)烈的水果香氣，并有蘋(píng)果、菠蘿、香蕉樣的香氣[6]。葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后3種主要酯類成分都高于其他2種方法處理的藍(lán)莓酒。特別是呈果香型的香氣物質(zhì)己酸乙酯的平均含量是對(duì)照組，即不加酶處理的藍(lán)莓酒的1.3倍并略高于藍(lán)莓原酒。

多數(shù)醇類具有不愉快的香氣，如：α-松油醇等，對(duì)果酒的香氣質(zhì)量呈負(fù)向貢獻(xiàn)。但苯乙醇的香味獨(dú)特，具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多樣風(fēng)味[15-16]。本研究結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒貯藏6個(gè)月后苯乙醇平均含量是對(duì)照組和其他2種方法處理的藍(lán)莓酒的1.55倍以上，而α-松油醇的平均含量則低于對(duì)照組和其他2種方法處理的藍(lán)莓酒以及藍(lán)莓原酒，說(shuō)明葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合除氧有利于提高藍(lán)莓酒的品質(zhì)。

萜烯類是果酒中的重要的香氣物質(zhì)。這類化合物具有令人愉悅的芳香氣味和極低的閾值[17]。有研究[18]認(rèn)為，由于烯類化合物分子中存在雙鍵，具有不飽和性，容易發(fā)生氧化、聚合、異構(gòu)化和分子重排等反應(yīng)；隨著酒液發(fā)酵程度的增強(qiáng)，二氧化碳?xì)怏w呈沸騰狀沖出發(fā)酵液面，極易帶走揮發(fā)性低閃點(diǎn)物質(zhì)。因而造成萜烯類香味成分在果酒發(fā)酵過(guò)程中容易喪失或發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)也表明，萜烯類香氣成分在藍(lán)莓酒貯藏過(guò)程中喪失較多，但葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒對(duì)萜烯類化合物的保持明顯優(yōu)于對(duì)照組和其他2種方法處理的的藍(lán)莓酒，其萜烯類化合物的平均含量是對(duì)照組和其他2種方法處理的藍(lán)莓酒的1.5倍以上。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取法，通過(guò)GC-MS分析，比較了不加葡萄糖氧化酶處理、葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理、葡萄糖氧化酶單獨(dú)處理、葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理并貯藏6個(gè)月的藍(lán)莓酒香氣成分。研究結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒中檢測(cè)到43種香氣成分，在4種貯藏6個(gè)月的藍(lán)莓酒中，香氣物質(zhì)總量最高，最接近藍(lán)莓原酒，其中酯類成分含量比原酒增加了4.2%，較好地保持了一些對(duì)果酒香氣質(zhì)量呈正向貢獻(xiàn)的典型香氣成分，有益于藍(lán)莓酒的貯藏。葡萄糖氧化酶和焦亞硫酸鈉聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒在香氣物質(zhì)總量、酯類成分含量、對(duì)果酒香氣質(zhì)量呈正向貢獻(xiàn)的典型香氣成分3個(gè)方面的保持效果不及葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶聯(lián)合處理的藍(lán)莓酒，但優(yōu)于葡萄糖氧化酶單獨(dú)處理的藍(lán)莓酒，對(duì)照組即不加葡萄糖氧化酶處理的藍(lán)莓酒在這3個(gè)方面的保持效果最差。

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Effectiveness of Glucose Oxidase on the Aromatic Composition of Blueberry Wine during Storage

LANRong，LIShuang-shi，XINXiu-lan*
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Using blueberry wine as samples，we tested several different glucose oxidase treatment methods fortheir effectiveness on aromatic compositions.Blueberry wines were treated with three kinds of treatment methodsincluding combined treatment of glucose oxidase and catalase，single treatment of glucose oxidase， combinedtreatment of glucose oxidase and sodium pyrosulfite，and treatment of sterile distilled water as a control. Allgroups were preserved at 4 ℃ .Using the method of SPME coupled with GC -MS， changes in aromaticcompositions were determined after six months' storage. We report here that three kinds of blueberry winestreated with different methods were superior to the control group at the keeping of the contents of total aromaticcompositions， esters， typical aromatic compositions having positive contribution to the aroma of fruit wine andthat combined treatment of glucose oxidase and catalase is the best choice and more favorable for the storage ofblueberry wine.

glucose oxidase；blueberry wine；aromatic composition；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.030

2014-11-17

北京市高等學(xué)校教學(xué)名師資助項(xiàng)目（PXM2014-014306-000075）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103037）；科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目-酶制劑研發(fā)基地建設(shè)（PXM2014_014306_000064）

蘭蓉（1974—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：酶制劑的應(yīng)用研究。

*通信作者：辛秀蘭（1968—），女（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的分離鑒定研究。