孫寧驍，宋桂龍

(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083)

近些年來，隨著我國城市化、工業(yè)化發(fā)展及農(nóng)用化學(xué)品的過量使用，環(huán)境污染、生態(tài)破壞日益嚴重，影響到人類的生存和健康，其中重金屬元素對環(huán)境的污染和破壞作用尤為嚴重［1］。Cd 是生物非必需的元素，對環(huán)境危害極大，它不僅會導(dǎo)致土壤正常的功能失調(diào)、質(zhì)量下降，而且會對植物產(chǎn)生毒害作用［2］。紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科多年生牧草，其適應(yīng)性強，雖然富集能力比不上很多超富集植物，但是由于生物量大、生長快，其富集總量甚至比超富集植物還要高［3］。到目前為止，Cd 對不同植物形態(tài)、生理等方面的影響已有大量研究［4-6］，但對紫花苜蓿在Cd 脅迫下生長發(fā)育的研究報道并不多。本研究分析紫花苜蓿對Cd 脅迫的反應(yīng)及積累特性，探討Cd 對紫花苜蓿的生理影響及紫花苜蓿在Cd 污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用潛力，旨在為紫花苜蓿在土壤修復(fù)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗地概況

紫花苜蓿(品種“新疆大葉苜?！?種子來源于北京林業(yè)大學(xué)草地資源實驗室，供試土壤為草炭土與農(nóng)田的表層土壤3∶ 1 混合。經(jīng)實驗室測定，土壤性質(zhì)pH 為6.79，全氮含量為3.65 g·kg－1，有機質(zhì)含量為127 g·kg－1，有效磷含量為20.9 mg·kg－1，有效鉀含量為262 mg·kg－1，土壤陽離子交換量為350 mmol·kg－1。盆栽試驗于北京林業(yè)大學(xué)氣象站后生物學(xué)院所屬溫室旁的院內(nèi)進行。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，對紫花苜蓿設(shè)置6 個Cd 處理水平，3 個重復(fù)，共計18 盆，每盆5 株。6 個處理的Cd 添加量從低到高依次為T0(0)，T1(10 mg · kg－1)，T2(25 mg · kg－1)，T3(50 mg·kg－1)，T4(100 mg · kg－1)和 T5(200 mg·kg－1)。試驗用塑料盆缽，直徑23 cm，高20 cm，每盆裝土4 kg。重金屬Cd 以CdCl2·2.5H2O(分析純試劑)形式，按不同處理水平加入土壤，并與土壤充分混合均勻，制成不同Cd 濃度的土壤，土壤穩(wěn)定一周后播種。播種后86 d 采集植物樣品測定生理指標，播種后106 d 收獲植株，處理后進行植物干重和重金屬Cd 含量的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 相對電導(dǎo)率 相對電導(dǎo)率的測定在陳建勛［7］的方法上稍有改動。稱取紫花苜蓿葉片0.1 g，剪成1 cm 的小段，置于試管中，加入25 mL 蒸餾水;用封口膜封口，室溫下?lián)u床振蕩24 h，用電導(dǎo)儀測電導(dǎo)率EL1;再次封口，牙簽扎孔通氣，沸水浴30 min，溫度降到室溫時測電導(dǎo)率EL2;將不加葉片的蒸餾水進行振蕩、沸水浴，將降到室溫時的電導(dǎo)率作為對照，記為EL0。根據(jù)公式(1)計算相對電導(dǎo)率:

1.3.2 脯氨酸含量的測定 參考酸性茚三酮法測定［8］，在此基礎(chǔ)上稍有改動。稱取紫花苜蓿葉片0.1 g，3%磺基水楊酸浸提，2.5%酸性茚三酮顯色，最后用2.5 mL 甲苯萃取，在520 nm 下使用721 型分光光度計比色測定。

1.3.3 葉片葉綠素含量的測定 根據(jù)張志良［9］的方法，稍有改動。稱紫花苜蓿葉片0.05 ～0.08 g，記下具體質(zhì)量，剪碎后置于離心管中;加入8 mL 95%的乙醇，室溫下避光靜置48 h;于665 nm、649 nm 測定其吸光值;用95%乙醇調(diào)空白。根據(jù)公式計算:

葉綠素a 含量=Ca·V/W;

葉綠素b 含量=Cb·V/W;

式中，Ca為葉綠素a 的濃度(mg·L－1);Cb為葉綠素b 的濃度(mg·L－1);A665和A649分別表示665 和649 nm 下的吸光值;V 為提取后的體積(L);W 為葉片鮮重(g)。

1.3.4 植物生物量的測定 收獲植物，沿土面剪取地上部分，同時洗出根系，烘箱內(nèi)105 ℃殺青15 min，并在80 ℃下烘至恒重，烘干后用天平稱量植物各部分干重。

1.3.5 植物體內(nèi)Cd 含量的測定 Cd 含量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定。

轉(zhuǎn)運系數(shù)=地上部植物中Cd 質(zhì)量分數(shù)/地下部植物中Cd 質(zhì)量分數(shù)［10］;

耐性指數(shù)=重金屬處理條件下植物干重/對照組植物干重［11］;

積累量=植物地上或根系Cd 積累濃度×植物地上或根系生物量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 17.0 軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，測定結(jié)果表示方法為平均值±標準誤，對不同Cd 濃度處理下紫花苜蓿各指標進行單因素方差分析，并用Duncan 法對測定數(shù)據(jù)進行多重比較;制圖采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cd 濃度對紫花苜蓿生長影響

不同濃度Cd 脅迫下紫花苜蓿的生長狀況如表1 所示，Cd 濃度達到200 mg·kg－1時，紫花苜蓿死亡。隨著Cd 濃度的增加，紫花苜蓿株高呈現(xiàn)遞減的趨勢。當Cd 濃度在50 和100 mg·kg－1時，株高與對照差異顯著(P ＜0.05)，降幅分別達到21.96%和30.65%;紫花苜蓿地上部和地下部干重隨Cd 濃度增加基本呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，Cd 濃度為25 mg·kg－1時，地上部干重達到最大，且與對照差異顯著，地下部干重在10 mg·kg－1時達到最大，但與對照差異不顯著(P ＞0.05)。

表1 紫花苜蓿的生長狀況Table 1 Growth of Medicago sativa

2.2 不同Cd 濃度對紫花苜蓿生理影響

2.2.1 紫花苜蓿相對電導(dǎo)率 Cd 濃度達到200 mg·kg－1時，紫花苜蓿死亡。隨Cd 濃度增加，葉片相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)遞增的趨勢(圖1)。Cd 濃度為10 mg·kg－1時，與對照差異不顯著(P ＞0.05);Cd 濃度增加至25 和50 mg·kg－1時，葉片相對電導(dǎo)率比對照顯著增加;當Cd 濃度達到100 mg·kg－1時，紫花苜蓿葉片相對電導(dǎo)率達到最大值，與其他處理差異顯著，相比對照增幅達到30.02%。

2.2.2 紫花苜蓿脯氨酸含量 隨Cd 濃度增加，葉片脯氨酸含量基本呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(圖2)。Cd 濃度達到25 mg·kg－1時，脯氨酸含量最高，與對照差異顯著(P ＜0. 05)，相比對照增幅達到34.74%;Cd濃度超過25 mg·kg－1后，脯氨酸含量逐漸下降;Cd 濃度達到100 mg·kg－1時，脯氨酸含量最低，且與其他處理差異顯著，與對照相比降幅到達33.60%。這表明，低濃度Cd 脅迫使紫花苜蓿體內(nèi)積累脯氨酸，維持正常代謝，高濃度Cd 脅迫使細胞機能喪失，不能積累脯氨酸以提高紫花苜蓿對Cd的抗性。

圖1 Cd 脅迫對紫花苜蓿電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effects of Cd stress on relative conductivity

圖2 Cd 脅迫對紫花苜蓿脯氨酸的影響Fig.2 Effects of Cd stress on proline content

2.2.3 紫花苜蓿葉綠素含量 隨Cd 濃度增加，葉綠素a、b 及總量都呈現(xiàn)遞減趨勢(表2)。Cd 濃度為10 mg·kg－1時，葉綠素含量略有下降，但與對照差異不顯著(P ＞0. 05);Cd 濃度為25 和50 mg·kg－1時，葉綠素a 和總量與對照差異顯著;Cd濃度為100 mg·kg－1時，葉綠素含量最低，與對照相比下降32.55%，且與其他處理差異顯著;葉綠素a/b 值隨Cd 濃度增加逐漸下降，但各個處理之間差異不顯著。這表明，Cd 脅迫對紫花苜蓿細胞膜造成損害，導(dǎo)致葉綠素合成受到影響，從而使葉綠素含量急劇降低，最終將導(dǎo)致光合作用的下降。

2.3 不同Cd 濃度紫花苜蓿積累特性

Cd 的積累濃度隨Cd 濃度增加而增加，且地下部Cd 積累濃度均大于地上部;Cd 濃度為10 mg·kg－1時轉(zhuǎn)運系數(shù)最高，但與25 和50 mg·kg－1差異不顯著(P ＞0.05);Cd 濃度為25 mg·kg－1時耐性指數(shù)最高，與其他處理差異顯著;Cd 濃度為25 mg·kg－1紫花苜蓿地上部積累量最大，與對照間差異顯著(P ＜0.05);Cd 濃度為100 mg·kg－1地下部積累量最大，與各處理之間差異顯著(表3)。

表2 Cd 脅迫對紫花苜蓿葉綠素的影響Table 2 Effects of Cd stress on chlorophyll content

表3 Cd 在紫花苜蓿體內(nèi)積累和分布Table 3 Cd concentration and distributing in Medicago sativa

3 討論與結(jié)論

Cd 是非營養(yǎng)元素，對植物有毒害作用，影響植物細胞代謝、生長發(fā)育并改變植物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)等［12-13］。在逆境條件下，當植物質(zhì)膜受損后，細胞會啟動響應(yīng)機制，具體表現(xiàn)為電解質(zhì)和某些小分子有機物大量滲漏［14］、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加(如脯氨酸)［15］以及葉綠素含量降低［16］等情況。

本研究結(jié)果表明，代表質(zhì)膜透性的相對電導(dǎo)率在Cd 脅迫條件下都出現(xiàn)顯著(P ＜0.05)增加的情況，這與相關(guān)研究［2］的結(jié)果相同。脯氨酸可以降低膜脂過氧化程度［17］，本研究中紫花苜蓿處于低濃度Cd 脅迫條件下，脯氨酸含量的增加可能增強紫花苜蓿的抗性，但當Cd 處理濃度過高時，紫花苜蓿細胞機能萎縮，甚至死亡，導(dǎo)致脯氨酸含量下降。本研究中紫花苜蓿葉綠素含量隨Cd 濃度增加而降低，這與相關(guān)研究結(jié)果相同［18-19］。葉綠素a/b值可作為葉片衰老的指標［20］，而試驗紫花苜蓿葉綠素a/b 值均隨Cd 濃度的增加而降低，說明高濃度的Cd 脅迫促進了紫花苜蓿葉片的衰老。

在實際修復(fù)中，紫花苜蓿對Cd 的去除效率主要取決于植株富集Cd 總量，即生物量與含Cd 濃度的乘積。因此，生物量與含Cd 濃度是兩項非常關(guān)鍵的指標。試驗中，低濃度Cd 脅迫可以增加紫花苜蓿地上部和地下部干重，這可能是由于紫花苜蓿體內(nèi)某些激素抵消了Cd 脅迫，促進了植物生長。從地上部積累量來看，Cd 濃度為25 mg·kg－1時紫花苜蓿積累量最大，每盆為42.5 μg，若紫花苜蓿干草產(chǎn)量以10 000 kg·hm－2計［21］，每公頃紫花苜蓿地上部可以富集85 g Cd，加以地下部富集量，在土壤Cd 濃度為25 mg·kg－1時，紫花苜?？偣部蓭ё叱^100 g Cd。在實際土壤修復(fù)中，若加以刈割、外施激素等農(nóng)藝措施，可能會進一步提高紫花苜蓿對Cd 污染土壤的修復(fù)效率。

綜上所述，Cd 脅迫引起紫花苜蓿葉片相對電導(dǎo)率增大，葉綠素含量降低，使葉片受到傷害;低濃度Cd 脅迫使紫花苜蓿葉片脯氨酸含量增加，促進了紫花苜蓿的生長，提高了紫花苜蓿在Cd 脅迫下的耐性指數(shù)，增加了地上部Cd 的積累量。由此可知，Cd濃度在25 mg·kg－1以下時，紫花苜蓿的生理狀況良好，在實際土壤修復(fù)中有應(yīng)用意義。

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