孫寧驍，宋桂龍

(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083)

近些年來，隨著我國城市化、工業(yè)化發(fā)展及農(nóng)用化學(xué)品的過量使用，環(huán)境污染、生態(tài)破壞日益嚴(yán)重，影響到人類的生存和健康，其中重金屬元素對(duì)環(huán)境的污染和破壞作用尤為嚴(yán)重［1］。Cd 是生物非必需的元素，對(duì)環(huán)境危害極大，它不僅會(huì)導(dǎo)致土壤正常的功能失調(diào)、質(zhì)量下降，而且會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［2］。紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科多年生牧草，其適應(yīng)性強(qiáng)，雖然富集能力比不上很多超富集植物，但是由于生物量大、生長快，其富集總量甚至比超富集植物還要高［3］。到目前為止，Cd 對(duì)不同植物形態(tài)、生理等方面的影響已有大量研究［4-6］，但對(duì)紫花苜蓿在Cd 脅迫下生長發(fā)育的研究報(bào)道并不多。本研究分析紫花苜蓿對(duì)Cd 脅迫的反應(yīng)及積累特性，探討Cd 對(duì)紫花苜蓿的生理影響及紫花苜蓿在Cd 污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用潛力，旨在為紫花苜蓿在土壤修復(fù)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗(yàn)地概況

紫花苜蓿(品種“新疆大葉苜?！?種子來源于北京林業(yè)大學(xué)草地資源實(shí)驗(yàn)室，供試土壤為草炭土與農(nóng)田的表層土壤3∶ 1 混合。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測定，土壤性質(zhì)pH 為6.79，全氮含量為3.65 g·kg－1，有機(jī)質(zhì)含量為127 g·kg－1，有效磷含量為20.9 mg·kg－1，有效鉀含量為262 mg·kg－1，土壤陽離子交換量為350 mmol·kg－1。盆栽試驗(yàn)于北京林業(yè)大學(xué)氣象站后生物學(xué)院所屬溫室旁的院內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，對(duì)紫花苜蓿設(shè)置6 個(gè)Cd 處理水平，3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)18 盆，每盆5 株。6 個(gè)處理的Cd 添加量從低到高依次為T0(0)，T1(10 mg · kg－1)，T2(25 mg · kg－1)，T3(50 mg·kg－1)，T4(100 mg · kg－1)和 T5(200 mg·kg－1)。試驗(yàn)用塑料盆缽，直徑23 cm，高20 cm，每盆裝土4 kg。重金屬Cd 以CdCl2·2.5H2O(分析純?cè)噭?形式，按不同處理水平加入土壤，并與土壤充分混合均勻，制成不同Cd 濃度的土壤，土壤穩(wěn)定一周后播種。播種后86 d 采集植物樣品測定生理指標(biāo)，播種后106 d 收獲植株，處理后進(jìn)行植物干重和重金屬Cd 含量的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 相對(duì)電導(dǎo)率 相對(duì)電導(dǎo)率的測定在陳建勛［7］的方法上稍有改動(dòng)。稱取紫花苜蓿葉片0.1 g，剪成1 cm 的小段，置于試管中，加入25 mL 蒸餾水;用封口膜封口，室溫下?lián)u床振蕩24 h，用電導(dǎo)儀測電導(dǎo)率EL1;再次封口，牙簽扎孔通氣，沸水浴30 min，溫度降到室溫時(shí)測電導(dǎo)率EL2;將不加葉片的蒸餾水進(jìn)行振蕩、沸水浴，將降到室溫時(shí)的電導(dǎo)率作為對(duì)照，記為EL0。根據(jù)公式(1)計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率:

1.3.2 脯氨酸含量的測定 參考酸性茚三酮法測定［8］，在此基礎(chǔ)上稍有改動(dòng)。稱取紫花苜蓿葉片0.1 g，3%磺基水楊酸浸提，2.5%酸性茚三酮顯色，最后用2.5 mL 甲苯萃取，在520 nm 下使用721 型分光光度計(jì)比色測定。

1.3.3 葉片葉綠素含量的測定 根據(jù)張志良［9］的方法，稍有改動(dòng)。稱紫花苜蓿葉片0.05 ～0.08 g，記下具體質(zhì)量，剪碎后置于離心管中;加入8 mL 95%的乙醇，室溫下避光靜置48 h;于665 nm、649 nm 測定其吸光值;用95%乙醇調(diào)空白。根據(jù)公式計(jì)算:

葉綠素a 含量=Ca·V/W;

葉綠素b 含量=Cb·V/W;

式中，Ca為葉綠素a 的濃度(mg·L－1);Cb為葉綠素b 的濃度(mg·L－1);A665和A649分別表示665 和649 nm 下的吸光值;V 為提取后的體積(L);W 為葉片鮮重(g)。

1.3.4 植物生物量的測定 收獲植物，沿土面剪取地上部分，同時(shí)洗出根系，烘箱內(nèi)105 ℃殺青15 min，并在80 ℃下烘至恒重，烘干后用天平稱量植物各部分干重。

1.3.5 植物體內(nèi)Cd 含量的測定 Cd 含量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定。

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部植物中Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/地下部植物中Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)［10］;

耐性指數(shù)=重金屬處理?xiàng)l件下植物干重/對(duì)照組植物干重［11］;

積累量=植物地上或根系Cd 積累濃度×植物地上或根系生物量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 17.0 軟件對(duì)所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，測定結(jié)果表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，對(duì)不同Cd 濃度處理下紫花苜蓿各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 法對(duì)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較;制圖采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cd 濃度對(duì)紫花苜蓿生長影響

不同濃度Cd 脅迫下紫花苜蓿的生長狀況如表1 所示，Cd 濃度達(dá)到200 mg·kg－1時(shí)，紫花苜蓿死亡。隨著Cd 濃度的增加，紫花苜蓿株高呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。當(dāng)Cd 濃度在50 和100 mg·kg－1時(shí)，株高與對(duì)照差異顯著(P ＜0.05)，降幅分別達(dá)到21.96%和30.65%;紫花苜蓿地上部和地下部干重隨Cd 濃度增加基本呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，Cd 濃度為25 mg·kg－1時(shí)，地上部干重達(dá)到最大，且與對(duì)照差異顯著，地下部干重在10 mg·kg－1時(shí)達(dá)到最大，但與對(duì)照差異不顯著(P ＞0.05)。

表1 紫花苜蓿的生長狀況Table 1 Growth of Medicago sativa

2.2 不同Cd 濃度對(duì)紫花苜蓿生理影響

2.2.1 紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率 Cd 濃度達(dá)到200 mg·kg－1時(shí)，紫花苜蓿死亡。隨Cd 濃度增加，葉片相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)(圖1)。Cd 濃度為10 mg·kg－1時(shí)，與對(duì)照差異不顯著(P ＞0.05);Cd 濃度增加至25 和50 mg·kg－1時(shí)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照顯著增加;當(dāng)Cd 濃度達(dá)到100 mg·kg－1時(shí)，紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到最大值，與其他處理差異顯著，相比對(duì)照增幅達(dá)到30.02%。

2.2.2 紫花苜蓿脯氨酸含量 隨Cd 濃度增加，葉片脯氨酸含量基本呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)(圖2)。Cd 濃度達(dá)到25 mg·kg－1時(shí)，脯氨酸含量最高，與對(duì)照差異顯著(P ＜0. 05)，相比對(duì)照增幅達(dá)到34.74%;Cd濃度超過25 mg·kg－1后，脯氨酸含量逐漸下降;Cd 濃度達(dá)到100 mg·kg－1時(shí)，脯氨酸含量最低，且與其他處理差異顯著，與對(duì)照相比降幅到達(dá)33.60%。這表明，低濃度Cd 脅迫使紫花苜蓿體內(nèi)積累脯氨酸，維持正常代謝，高濃度Cd 脅迫使細(xì)胞機(jī)能喪失，不能積累脯氨酸以提高紫花苜蓿對(duì)Cd的抗性。

圖1 Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effects of Cd stress on relative conductivity

圖2 Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿脯氨酸的影響Fig.2 Effects of Cd stress on proline content

2.2.3 紫花苜蓿葉綠素含量 隨Cd 濃度增加，葉綠素a、b 及總量都呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(表2)。Cd 濃度為10 mg·kg－1時(shí)，葉綠素含量略有下降，但與對(duì)照差異不顯著(P ＞0. 05);Cd 濃度為25 和50 mg·kg－1時(shí)，葉綠素a 和總量與對(duì)照差異顯著;Cd濃度為100 mg·kg－1時(shí)，葉綠素含量最低，與對(duì)照相比下降32.55%，且與其他處理差異顯著;葉綠素a/b 值隨Cd 濃度增加逐漸下降，但各個(gè)處理之間差異不顯著。這表明，Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞膜造成損害，導(dǎo)致葉綠素合成受到影響，從而使葉綠素含量急劇降低，最終將導(dǎo)致光合作用的下降。

2.3 不同Cd 濃度紫花苜蓿積累特性

Cd 的積累濃度隨Cd 濃度增加而增加，且地下部Cd 積累濃度均大于地上部;Cd 濃度為10 mg·kg－1時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最高，但與25 和50 mg·kg－1差異不顯著(P ＞0.05);Cd 濃度為25 mg·kg－1時(shí)耐性指數(shù)最高，與其他處理差異顯著;Cd 濃度為25 mg·kg－1紫花苜蓿地上部積累量最大，與對(duì)照間差異顯著(P ＜0.05);Cd 濃度為100 mg·kg－1地下部積累量最大，與各處理之間差異顯著(表3)。

表2 Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿葉綠素的影響Table 2 Effects of Cd stress on chlorophyll content

表3 Cd 在紫花苜蓿體內(nèi)積累和分布Table 3 Cd concentration and distributing in Medicago sativa

3 討論與結(jié)論

Cd 是非營養(yǎng)元素，對(duì)植物有毒害作用，影響植物細(xì)胞代謝、生長發(fā)育并改變植物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)等［12-13］。在逆境條件下，當(dāng)植物質(zhì)膜受損后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)響應(yīng)機(jī)制，具體表現(xiàn)為電解質(zhì)和某些小分子有機(jī)物大量滲漏［14］、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加(如脯氨酸)［15］以及葉綠素含量降低［16］等情況。

本研究結(jié)果表明，代表質(zhì)膜透性的相對(duì)電導(dǎo)率在Cd 脅迫條件下都出現(xiàn)顯著(P ＜0.05)增加的情況，這與相關(guān)研究［2］的結(jié)果相同。脯氨酸可以降低膜脂過氧化程度［17］，本研究中紫花苜蓿處于低濃度Cd 脅迫條件下，脯氨酸含量的增加可能增強(qiáng)紫花苜蓿的抗性，但當(dāng)Cd 處理濃度過高時(shí)，紫花苜蓿細(xì)胞機(jī)能萎縮，甚至死亡，導(dǎo)致脯氨酸含量下降。本研究中紫花苜蓿葉綠素含量隨Cd 濃度增加而降低，這與相關(guān)研究結(jié)果相同［18-19］。葉綠素a/b值可作為葉片衰老的指標(biāo)［20］，而試驗(yàn)紫花苜蓿葉綠素a/b 值均隨Cd 濃度的增加而降低，說明高濃度的Cd 脅迫促進(jìn)了紫花苜蓿葉片的衰老。

在實(shí)際修復(fù)中，紫花苜蓿對(duì)Cd 的去除效率主要取決于植株富集Cd 總量，即生物量與含Cd 濃度的乘積。因此，生物量與含Cd 濃度是兩項(xiàng)非常關(guān)鍵的指標(biāo)。試驗(yàn)中，低濃度Cd 脅迫可以增加紫花苜蓿地上部和地下部干重，這可能是由于紫花苜蓿體內(nèi)某些激素抵消了Cd 脅迫，促進(jìn)了植物生長。從地上部積累量來看，Cd 濃度為25 mg·kg－1時(shí)紫花苜蓿積累量最大，每盆為42.5 μg，若紫花苜蓿干草產(chǎn)量以10 000 kg·hm－2計(jì)［21］，每公頃紫花苜蓿地上部可以富集85 g Cd，加以地下部富集量，在土壤Cd 濃度為25 mg·kg－1時(shí)，紫花苜?？偣部蓭ё叱^100 g Cd。在實(shí)際土壤修復(fù)中，若加以刈割、外施激素等農(nóng)藝措施，可能會(huì)進(jìn)一步提高紫花苜蓿對(duì)Cd 污染土壤的修復(fù)效率。

綜上所述，Cd 脅迫引起紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率增大，葉綠素含量降低，使葉片受到傷害;低濃度Cd 脅迫使紫花苜蓿葉片脯氨酸含量增加，促進(jìn)了紫花苜蓿的生長，提高了紫花苜蓿在Cd 脅迫下的耐性指數(shù)，增加了地上部Cd 的積累量。由此可知，Cd濃度在25 mg·kg－1以下時(shí)，紫花苜蓿的生理狀況良好，在實(shí)際土壤修復(fù)中有應(yīng)用意義。

［1］ 王?；?，郇恒福，羅瑛，劉壯，高玲，黎春花，劉國道.土壤重金屬污染及植物修復(fù)技術(shù)［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(11):210-214.

［2］ 張呈祥，陳為峰.草地早熟禾對(duì)鎘脅迫的反應(yīng)及積累特性［J］.中國草地學(xué)報(bào)，2012，34(4):61-67.

［3］ 張杏鋒，夏漢平，李志安，李海防，熊燕梅.牧草對(duì)重金屬污染土壤的植物修復(fù)綜述［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2009，28(8):1640-1646.

［4］ 胡鐘勝，章鋼婭，王廣志，招啟柏，劉秀麗，曹顯祖，曹志洪.改良劑對(duì)煙草吸收土壤中鎘鉛影響的研究［J］. 土壤學(xué)報(bào)，2006，43(2):233-239.

［5］ Klang-Westin E，Eriksson J. Potential of Salix as phytoextractor for Cd on moderately contaminated soils［J］. Plant and Soil，2003，249(1):127-137.

［6］ 曹會(huì)聰，王金達(dá)，任慧敏，趙衛(wèi)，張學(xué)林.土壤鎘暴露對(duì)玉米和大豆的生態(tài)毒性評(píng)估［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(2):298-303.

［7］ 陳建勛.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.廣州:華南理工大學(xué)出版社，2002:64-65.

［8］ 李明，王根軒.干旱脅迫對(duì)甘草幼苗保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22(4):503-507.

［9］ 張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，1990:67-70.

［10］ Baker A J M，Reeves R D，Hajar A S M. Heavy metal accumulation and tolerance in British populations of the metallophyte Thlaspi caerulescens J. and C.Presl (Brassicaceae)［J］.New Phytologist，1994，127(1):61-68.

［11］ 格默爾.工業(yè)廢棄地上植物定居［M］.倪彭年，李玲英，譯.北京科學(xué)技術(shù)出版社，1987.

［12］ Lamsal B P，Koegel R G，Gunasekaran S.Some physicochemical and functional propertyes of alfalfa soluble leaf proteins［J］.LWT-Food Science and Technology，2006，40(9):1520-1526.

［13］ Aina R，Labra M，F(xiàn)umagalli P，Vannini C，Marsoni M，Cucchi U，Bracale M，Sgorbati S，Citterio S.Thiol-peptide level and proteomic changes in response to cadmium toxicity in Oryza sativa L.roots［J］.Environmental and Experimental Botany，2007，59(3):381-392.

［14］ 馬士芳，沈向群，洪雅婷，陳永浩，郭艷鋒，李林.根腫病(Plasmodiophora brassicae)菌侵染對(duì)大白菜幼苗葉片膜脂過氧化的影響［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30(1):128-132.

［15］ 劉旻霞，馬建祖.6 種植物在逆境脅迫下脯氨酸的累積特點(diǎn)研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27(4):134-138.

［16］ 許潔，曲東，周莉娜.硫營養(yǎng)對(duì)鋅和干旱脅迫下玉米葉片中葉綠素含量的影響［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26(2):33-37.

［17］ Smirnoff N.The role of active oxygen in the response of plants to water deficit and desiccation［J］.New Phytologist，1993，125(1):27-58.

［18］ 原海燕，郭智，張開明，黃蘇珍，夏采意. 兩種鳶尾屬花卉幼苗對(duì)鎘脅迫的生理抗性研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(5):63-65.

［19］ 袁祖麗，馬新明，韓錦峰，李春明，吳葆存. 鎘污染對(duì)煙草葉片超微結(jié)構(gòu)及部分元素含量的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(11):127-135.

［20］ 張明生，談鋒.水分脅迫下甘薯葉綠素a/b 比值的變化及其與抗旱性的關(guān)系［J］.種子，2001(4):23-25.

［21］ 劉世亮，馬闖，介曉磊，劉芳，崔海燕，華黨領(lǐng)，胡華鋒.噴施亞硒酸鈉對(duì)紫花苜蓿干草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2008，25(8):73-78.