劉晨旭，馬 欣，董鳳麗，周蘊薇

（東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱150040）

地被菊（Chr ysanthemum morifolium）是菊科菊屬多年生草本花卉，是菊花的一個新品種群。具有植株低矮、株型緊湊、花色豐富、抗性強等優(yōu)點。近年來，植物基因工程的發(fā)展為加快培養(yǎng)具有優(yōu)良特性的菊花品種提供了可能，特別是在分子育種方面，可以利用現(xiàn)代分子生物學技術和方法定向修飾菊花的某些目標性狀，使其在抗逆性、花色、花期等方面具有更強的優(yōu)勢［1］。利用農(nóng)桿菌介導法將抗性基因轉(zhuǎn)入到菊花的研究已取得了很大成功［2－4］。但基因轉(zhuǎn)化需要建立良好的植物受體系統(tǒng)，其中外植體的選擇以及能產(chǎn)生較高再生能力的培養(yǎng)體系的確立是轉(zhuǎn)化體系建立的關鍵［5］。目前，菊花的再生體系研究已經(jīng)普遍展開。通過調(diào)節(jié)不同的激素種類和濃度配比，利用莖段［6］、葉 片［7－8］、葉 柄［1］、花 瓣［9］、花 蕾［10］等 作 為 外植體，建立起高效、快捷的再生體系已經(jīng)成為了可能。但由于菊花受基因型影響較大，不同品種之間存在一定差異，所以再生體系一般不具有普遍性。呂 晉 慧 等［11］對 地 被 菊 品 種 ‘紫 妍’（C.morif olium cv.ziyan）進行了葉片不定芽的再生研究，初步研究了‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基。本研究以地被菊‘紫妍’和‘紐9722’（C.morif olium cv.niu 9722）為研究對象，探索葉片愈傷組織的誘導、芽的分化、莖的增殖以及繼代生根的最適宜條件，旨在篩選出高效、穩(wěn)定的再生體系，以期為今后的地被菊轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎，加快分子育種進程。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇東北林業(yè)大學園林學院花卉研究所內(nèi)地被菊‘紫妍’、‘紐9722’的帶腋芽莖段為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得及最佳消毒時間的篩選 將采集到的‘紫妍’、‘紐9722’帶腋芽莖段去除底部和中部的大葉子，用洗衣粉浸泡5 min后，洗去表面泥土，再在流水下沖泡1～2 h，徹底洗凈。放入超凈工作臺，75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗兩次后放入配好的2% NaCl O 溶液中分別浸泡2、4、6、8、10 min，期間不停搖晃，使之與莖段充分接觸，無菌水徹底沖洗4～5 次，取出后用無菌濾紙吸凈表面水分，接入MS培養(yǎng)基上。10 d 后統(tǒng)計死亡率、污染率、萌發(fā)率。

1.2.2 葉片愈傷組織的誘導及芽的分化 待植株正常生長后，選擇繼代20 d左右生長狀況良好的植株，將其中部及上部發(fā)育狀況基本一致的葉片剪下，切成5 mm×5 mm 的葉盤，近軸面接觸培養(yǎng)基，接種于MS培養(yǎng)基添加不同濃度6－BA（1.0、1.5、2.0 mg·L－1）和NAA（0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mg·L－1）中，誘導葉片愈傷組織的形成及芽的分化。每個處理接種30個葉片，3次重復。12 d更換一次培養(yǎng)基，15 d統(tǒng)計愈傷組織誘導率，40 d統(tǒng)計芽的分化率和出芽數(shù)。

1.2.3 莖段的增殖 選擇繼代20 d左右生長狀況良好的‘紐9722’無菌苗，切取帶兩個腋芽的莖段，接入到MS培養(yǎng)基添加不同濃度6－BA（0、1.0、2.0、3.0 mg·L－1）和NAA（0、0.2、0.5、1.0 mg·L－1）中，觀察‘紐9722’莖段的增殖情況。每個處理接種20個莖段，3 次重復。12 d更換一次培養(yǎng)基，觀察植株生長及增殖情況，30 d統(tǒng)計莖段增殖系數(shù)。

1.2.4 繼代生根誘導 待分化出的不定芽生長健康后，切取約2 c m 不定芽接入MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L－1）和1／2 MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L－1）中誘導生根。每個處理接種10個不定芽，3次重復，觀察根及植株生長情況，20 d時計生根數(shù)和生根率。

1.2.5 煉苗和移栽 生根的組培苗約20 d時，選擇根系發(fā)達且生長健壯的組培苗，將其去膜放置2 d進行煉苗，然后拿出并洗凈根部的殘余培養(yǎng)基，將其移栽至提前高溫滅菌后的土中（土∶蛭石＝1∶1），放至適當環(huán)境下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.3 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，含蔗糖30 mg·L－1、瓊脂7～8 g·L－1，p H 5.8；1／2 MS 培養(yǎng)基中大量元素減半，p H 值不變。121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度是（25±2）℃，光照強度是2 000 l x，光照時間是12 h·d－1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

參照汪曉沙等［12］的計算方法：

污染率＝（污染個數(shù)／接種個數(shù)）×100%；

萌發(fā)率＝（萌發(fā)個數(shù)／存活個數(shù)）×100%；

誘導率＝（形成愈傷組織的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%；

再生頻率＝（再生出不定芽的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%；

外植體平均再生芽數(shù)＝外植體再生不定芽總數(shù)／接種外植體數(shù)；

莖段外植體增殖系數(shù)＝外植體增殖不定芽總數(shù)／接種外植體數(shù)；

生根率＝（生根幼苗數(shù)／接種幼苗數(shù)）×100%；

生根系數(shù)＝生根總數(shù)／生根幼苗數(shù)。

數(shù)據(jù)處理采用EXCEL、SPSS 17.0 軟件進行ANOVA 顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體消毒及出芽狀況的影響

兩個品種的污染率均隨著消毒時間的增加而減?。ū?），表明2%的Na Cl O 溶液對莖段的消毒效果明顯。萌發(fā)率也隨著消毒時間的增加而減小，過高濃度Na Cl O 溶液可能傷害幼嫩莖段，影響其萌發(fā)。對于‘紫妍’品種，6 min及以上的消毒時間對污染率的影響差異不顯著（P＞0.05），而6 min及以內(nèi)的消毒時間對萌發(fā)率影響差異不顯著，綜合兩個因素，6 min是對于品種‘紫妍’最適宜的消毒時間。品種‘紐9722’在8 min時污染率較低，雖然與10 min處理的污染率差異不顯著，但萌發(fā)率顯著高于10 min的處理（P＜0.05），所以8 min是最好的消毒時間。

2.2 不同激素濃度對葉片分化的影響

添加不同濃度6－BA 和NAA 的培養(yǎng)基對于地被菊葉片的分化起著較大的作用（表2）。通過試驗觀察，葉片接觸分化培養(yǎng)基7 d左右時，在切口處開始形成嫩綠的愈傷組織。愈傷組織逐漸增大，15 d后出現(xiàn)大量嫩綠色芽點，3～4周芽點開始長成小芽叢，并逐漸增多、長大。選擇的激素濃度配比對于兩個品種均能誘導出愈傷組織，誘導率均為100%。品種‘紫妍’總體分化率較高，6－BA 濃度不變時，1.0 mg·L－1的NAA 最能促進分化，且出芽數(shù)較高，過低和過高的NAA 都會使分化率下降；當6－BA 濃度為1.5和2.0 mg·L－1時，1.0 mg·L－1NAA 下，分化率都很高，顯著高于其他濃度（P＜0.05）且二者差異不顯著（P＞0.05），但6－BA 為2.0 mg·L－1時的出芽數(shù)顯著高于1.5 mg·L－1時的出芽數(shù)（P＜0.05），所以品種‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基是MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 1.0 mg·L－1。品種‘紐9722’的最高分化率出現(xiàn)在MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1時，但僅為45.59%。

表1 不同消毒時間對兩個地被菊品種外植體污染和萌發(fā)的影響Table 1 Effects of sterilization ti me on explants’contamination and ger mination efficiency of t wo C.morif olium cultivars

表2 不同濃度的6－BA和NAA對兩個地被菊品種葉片分化的影響Table 2 Effects of 6－BA and NAA on the differentiation capability of leaf blades of t wo C.morif olium cultivars

表3 不同6－BA和NAA濃度對‘紐9722’莖段增殖的影響Table 3 Effects of 6－BA and NAA on the proliferation of stem segments of C.morif olium ‘niu 9722’

2.3 不同激素濃度對‘紐9722’莖段增殖的影響

接種3 d時，莖段傷口處膨大，10 d時莖段腋芽處開始有叢生芽萌發(fā)，且叢生芽生長很快?？傮w而言，品種‘紐9722’的莖段增殖狀況良好（表3），當6－BA 2.0 mg·L－1且NAA 0.5 mg·L－1時，增殖數(shù)最高，達到了10.05，與其他濃度處理相比差異顯著（P＜0.05），且生長狀況良好，是其莖段增殖的最適培養(yǎng)基。

2.4 不同培養(yǎng)基對生根的影響

生根培養(yǎng)7 d時，基部開始生根，14 d后大量生根，生根率均為100%。在兩種基本培養(yǎng)基中，隨著添加NAA 濃度的增加，兩個品種的生根系數(shù)均先增加后減少（表4、表5）。品種‘紫妍’在添加0.2 mg·L－1的NAA 的兩種基本培養(yǎng)基中生根系數(shù)都很高，分別為13.53（MS）和15.50（1／2 MS），且根系多、粗、密集，但后者顯著高于前者（P＜0.05）；品種‘紐9722’在添加0.3 mg·L－1NAA 的1／2 MS培養(yǎng)基中生根系數(shù)達到最高，為14.87，顯著高于其他處理（P ＜0.05），根系多、粗、密集。所以，品種‘紫妍’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋NAA 0.2 mg·L－1；品種‘紐9722’的最適生根培養(yǎng)基為1／2MS＋NAA 0.3 mg·L－1。

表4 基本培養(yǎng)基添加不同濃度NAA對兩個地被菊品種生根的影響Table 4 Effects of NAA in basic mediu m on rooting of t wo C.morif olium cultivars

經(jīng)過煉苗和移栽30 d 后，品種‘紫妍’、‘紐9722’成活率均為100%，且長勢良好（圖1、圖2）。兩個品種經(jīng)過脫毒、葉片分化、莖段增殖、生根移栽過程，建立起完整的再生體系。

3 討論與結(jié)論

菊花品種的外植體選擇種類較多，多數(shù)研究以葉片和莖段為外植體，獲得了再生率較高的再生體系。相比而言，利用莖段為外植體獲取較為方便，且受強消毒劑影響程度較小，與葉片相比，莖段誘導無菌苗更快捷，周期更短。大量研究證明，0.1%升汞具有良好的消毒效果［13］，但升汞對環(huán)境有一定的污染，用后必須回收處理，本研究采用2% Na Cl O 溶液進行外植體脫毒，效果良好，和馬欣等［14］的研究結(jié)果基本符合，并且環(huán)保無污染?！襄?、‘紐9722’莖段脫毒的最適時間分別是6、8 min，不同的品種基因型存在差異，植物體本身對于消毒劑的抗性也不同，葉片的薄厚、莖段的粗細也有可能是造成最適消毒時間差異的原因。

在誘導葉片分化不定芽時，以往多數(shù)研究表明［10，12］，6－BA 和NAA 的組合對誘導愈傷組織效果明顯。本研究中，品種‘紫妍’的葉片最適分化培養(yǎng)基 為 MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 1.0 mg·L－1，最高分化率為92.22%，出芽數(shù)為7.60。呂晉慧等［11］的研究也表明品種‘紫妍’在這一激素配比下的分化率最高，為93%，出芽數(shù)為12.4；‘紫妍’在 MS＋6－BA 1.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1時分化率也很高，本研究與之存在差異，可能是試驗季節(jié)、試驗環(huán)境條件的不同引起的。通過觀察發(fā)現(xiàn)，當6－BA 濃 度 一 定，NAA 濃 度 較 低（0.2 mg·L－1）時，愈傷組織雖然出芽率不高，但較為致密、緊實（圖3 A）。而NAA 濃度在0.5 mg·L－1時，愈傷組織容易成疏松水漬狀，不定芽也容易玻璃化（圖3B）。原因可能是低濃度NAA 有利于促進愈傷組織的形成。而對于品種‘紐9722’，葉片最高分化率僅為45.59%，沒有成功建立穩(wěn)定的再生體系，通過觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織體積較大，但出芽率過低，而且褐化情況較嚴重（圖3C），這一問題還需進一步研究解決。

圖1 ‘紫妍’再生體系建立的過程Fig.1 The establishment process of‘ziyan’regeneration system

王麗華等［15］研究發(fā)現(xiàn)，過高的6－BA 濃度和過低的NAA 濃度會使植株的長勢變?nèi)?；但吳月亮等?］的研究表明，6－BA濃度與NAA濃度之比大于10時，增殖效果最好。本研究表明，‘紐9722’的最適莖段增殖培養(yǎng) 基 是MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1，增殖后的無菌苗生長良好，增殖系數(shù)為10.05，高于之前一些品種的增殖研究，表明不同品種同在最適增殖培養(yǎng)基下，增殖系數(shù)有差異。

圖2 ‘紐9722’再生體系建立的過程Fig.2 The establishment process of‘niu 9722’regeneration system

地被菊較容易生根，多而粗壯的根系有利于植株的移栽成活，使得建立起來的再生體系更加完整。MS培養(yǎng)基是用來繼代無菌苗的常用培養(yǎng)基，既能使幼苗地下部分生根，又能使地上部分健壯生長。但一般生根培養(yǎng)基為1／2 MS和1／2 MS添加低濃度NAA 或IBA。品種‘早小菊’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋IBA 3.0 mg·L－1［10］，1／2 MS＋NAA 0.1 mg·L－1最適宜品種‘神馬’和‘綠鸚哥’生根［16－17］?？?見，IBA 和NAA 對 于 不 同 品 種 的 生 根有著不同的影響，主要與基因型有關。有的研究表明，少量活性炭的添加能夠促進生根，如品種‘日本紅’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋NAA 0.8 mg·L－1＋活性炭1.0 g·L－1［18］。本研究表明，品種‘紫妍’最適生根培養(yǎng)基是1／2 MS＋NAA 0.2 mg·L－1，生根系數(shù)為15.50；品種‘紐9722’最適生根培養(yǎng)基是1／2 MS＋NAA 0.3 mg·L－1，生根系數(shù)為14.87，與大多數(shù)研究基本一致。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度的NAA 會促進根的增粗，但同時影響了根的增多和伸長，當NAA 濃度大于0.4 mg·L－1時，能明顯觀察到無菌苗根部切口處褐化、粗大，抑制了根的生長，導致根發(fā)生畸形，同時觀察到地上部分生長緩慢，可能的原因是過高的NAA使根部褐化，抑制了營養(yǎng)從根部向上的運輸。

圖3 NAA處理的‘紫妍’和‘紐9722’的愈傷組織形態(tài)Fig.3 The callus mor phological of‘niu 9722’and‘ziyan’treated with NAA

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