劉晨旭，馬 欣，董鳳麗，周蘊(yùn)薇

（東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

地被菊（Chr ysanthemum morifolium）是菊科菊屬多年生草本花卉，是菊花的一個(gè)新品種群。具有植株低矮、株型緊湊、花色豐富、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來，植物基因工程的發(fā)展為加快培養(yǎng)具有優(yōu)良特性的菊花品種提供了可能，特別是在分子育種方面，可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和方法定向修飾菊花的某些目標(biāo)性狀，使其在抗逆性、花色、花期等方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)［1］。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗性基因轉(zhuǎn)入到菊花的研究已取得了很大成功［2－4］。但基因轉(zhuǎn)化需要建立良好的植物受體系統(tǒng)，其中外植體的選擇以及能產(chǎn)生較高再生能力的培養(yǎng)體系的確立是轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵［5］。目前，菊花的再生體系研究已經(jīng)普遍展開。通過調(diào)節(jié)不同的激素種類和濃度配比，利用莖段［6］、葉 片［7－8］、葉 柄［1］、花 瓣［9］、花 蕾［10］等 作 為 外植體，建立起高效、快捷的再生體系已經(jīng)成為了可能。但由于菊花受基因型影響較大，不同品種之間存在一定差異，所以再生體系一般不具有普遍性。呂 晉 慧 等［11］對(duì) 地 被 菊 品 種 ‘紫 妍’（C.morif olium cv.ziyan）進(jìn)行了葉片不定芽的再生研究，初步研究了‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基。本研究以地被菊‘紫妍’和‘紐9722’（C.morif olium cv.niu 9722）為研究對(duì)象，探索葉片愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的分化、莖的增殖以及繼代生根的最適宜條件，旨在篩選出高效、穩(wěn)定的再生體系，以期為今后的地被菊轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)，加快分子育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花卉研究所內(nèi)地被菊‘紫妍’、‘紐9722’的帶腋芽莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的獲得及最佳消毒時(shí)間的篩選 將采集到的‘紫妍’、‘紐9722’帶腋芽莖段去除底部和中部的大葉子，用洗衣粉浸泡5 min后，洗去表面泥土，再在流水下沖泡1～2 h，徹底洗凈。放入超凈工作臺(tái)，75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗兩次后放入配好的2% NaCl O 溶液中分別浸泡2、4、6、8、10 min，期間不停搖晃，使之與莖段充分接觸，無菌水徹底沖洗4～5 次，取出后用無菌濾紙吸凈表面水分，接入MS培養(yǎng)基上。10 d 后統(tǒng)計(jì)死亡率、污染率、萌發(fā)率。

1.2.2 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及芽的分化 待植株正常生長(zhǎng)后，選擇繼代20 d左右生長(zhǎng)狀況良好的植株，將其中部及上部發(fā)育狀況基本一致的葉片剪下，切成5 mm×5 mm 的葉盤，近軸面接觸培養(yǎng)基，接種于MS培養(yǎng)基添加不同濃度6－BA（1.0、1.5、2.0 mg·L－1）和NAA（0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mg·L－1）中，誘導(dǎo)葉片愈傷組織的形成及芽的分化。每個(gè)處理接種30個(gè)葉片，3次重復(fù)。12 d更換一次培養(yǎng)基，15 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，40 d統(tǒng)計(jì)芽的分化率和出芽數(shù)。

1.2.3 莖段的增殖 選擇繼代20 d左右生長(zhǎng)狀況良好的‘紐9722’無菌苗，切取帶兩個(gè)腋芽的莖段，接入到MS培養(yǎng)基添加不同濃度6－BA（0、1.0、2.0、3.0 mg·L－1）和NAA（0、0.2、0.5、1.0 mg·L－1）中，觀察‘紐9722’莖段的增殖情況。每個(gè)處理接種20個(gè)莖段，3 次重復(fù)。12 d更換一次培養(yǎng)基，觀察植株生長(zhǎng)及增殖情況，30 d統(tǒng)計(jì)莖段增殖系數(shù)。

1.2.4 繼代生根誘導(dǎo) 待分化出的不定芽生長(zhǎng)健康后，切取約2 c m 不定芽接入MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L－1）和1／2 MS培養(yǎng)基添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L－1）中誘導(dǎo)生根。每個(gè)處理接種10個(gè)不定芽，3次重復(fù)，觀察根及植株生長(zhǎng)情況，20 d時(shí)計(jì)生根數(shù)和生根率。

1.2.5 煉苗和移栽 生根的組培苗約20 d時(shí)，選擇根系發(fā)達(dá)且生長(zhǎng)健壯的組培苗，將其去膜放置2 d進(jìn)行煉苗，然后拿出并洗凈根部的殘余培養(yǎng)基，將其移栽至提前高溫滅菌后的土中（土∶蛭石＝1∶1），放至適當(dāng)環(huán)境下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，含蔗糖30 mg·L－1、瓊脂7～8 g·L－1，p H 5.8；1／2 MS 培養(yǎng)基中大量元素減半，p H 值不變。121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度是（25±2）℃，光照強(qiáng)度是2 000 l x，光照時(shí)間是12 h·d－1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

參照汪曉沙等［12］的計(jì)算方法：

污染率＝（污染個(gè)數(shù)／接種個(gè)數(shù)）×100%；

萌發(fā)率＝（萌發(fā)個(gè)數(shù)／存活個(gè)數(shù)）×100%；

誘導(dǎo)率＝（形成愈傷組織的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%；

再生頻率＝（再生出不定芽的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100%；

外植體平均再生芽數(shù)＝外植體再生不定芽總數(shù)／接種外植體數(shù)；

莖段外植體增殖系數(shù)＝外植體增殖不定芽總數(shù)／接種外植體數(shù)；

生根率＝（生根幼苗數(shù)／接種幼苗數(shù)）×100%；

生根系數(shù)＝生根總數(shù)／生根幼苗數(shù)。

數(shù)據(jù)處理采用EXCEL、SPSS 17.0 軟件進(jìn)行ANOVA 顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒及出芽狀況的影響

兩個(gè)品種的污染率均隨著消毒時(shí)間的增加而減?。ū?），表明2%的Na Cl O 溶液對(duì)莖段的消毒效果明顯。萌發(fā)率也隨著消毒時(shí)間的增加而減小，過高濃度Na Cl O 溶液可能傷害幼嫩莖段，影響其萌發(fā)。對(duì)于‘紫妍’品種，6 min及以上的消毒時(shí)間對(duì)污染率的影響差異不顯著（P＞0.05），而6 min及以內(nèi)的消毒時(shí)間對(duì)萌發(fā)率影響差異不顯著，綜合兩個(gè)因素，6 min是對(duì)于品種‘紫妍’最適宜的消毒時(shí)間。品種‘紐9722’在8 min時(shí)污染率較低，雖然與10 min處理的污染率差異不顯著，但萌發(fā)率顯著高于10 min的處理（P＜0.05），所以8 min是最好的消毒時(shí)間。

2.2 不同激素濃度對(duì)葉片分化的影響

添加不同濃度6－BA 和NAA 的培養(yǎng)基對(duì)于地被菊葉片的分化起著較大的作用（表2）。通過試驗(yàn)觀察，葉片接觸分化培養(yǎng)基7 d左右時(shí)，在切口處開始形成嫩綠的愈傷組織。愈傷組織逐漸增大，15 d后出現(xiàn)大量嫩綠色芽點(diǎn)，3～4周芽點(diǎn)開始長(zhǎng)成小芽叢，并逐漸增多、長(zhǎng)大。選擇的激素濃度配比對(duì)于兩個(gè)品種均能誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率均為100%。品種‘紫妍’總體分化率較高，6－BA 濃度不變時(shí)，1.0 mg·L－1的NAA 最能促進(jìn)分化，且出芽數(shù)較高，過低和過高的NAA 都會(huì)使分化率下降；當(dāng)6－BA 濃度為1.5和2.0 mg·L－1時(shí)，1.0 mg·L－1NAA 下，分化率都很高，顯著高于其他濃度（P＜0.05）且二者差異不顯著（P＞0.05），但6－BA 為2.0 mg·L－1時(shí)的出芽數(shù)顯著高于1.5 mg·L－1時(shí)的出芽數(shù)（P＜0.05），所以品種‘紫妍’的最適葉片分化培養(yǎng)基是MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 1.0 mg·L－1。品種‘紐9722’的最高分化率出現(xiàn)在MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1時(shí)，但僅為45.59%。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)兩個(gè)地被菊品種外植體污染和萌發(fā)的影響Table 1 Effects of sterilization ti me on explants’contamination and ger mination efficiency of t wo C.morif olium cultivars

表2 不同濃度的6－BA和NAA對(duì)兩個(gè)地被菊品種葉片分化的影響Table 2 Effects of 6－BA and NAA on the differentiation capability of leaf blades of t wo C.morif olium cultivars

表3 不同6－BA和NAA濃度對(duì)‘紐9722’莖段增殖的影響Table 3 Effects of 6－BA and NAA on the proliferation of stem segments of C.morif olium ‘niu 9722’

2.3 不同激素濃度對(duì)‘紐9722’莖段增殖的影響

接種3 d時(shí)，莖段傷口處膨大，10 d時(shí)莖段腋芽處開始有叢生芽萌發(fā)，且叢生芽生長(zhǎng)很快?？傮w而言，品種‘紐9722’的莖段增殖狀況良好（表3），當(dāng)6－BA 2.0 mg·L－1且NAA 0.5 mg·L－1時(shí)，增殖數(shù)最高，達(dá)到了10.05，與其他濃度處理相比差異顯著（P＜0.05），且生長(zhǎng)狀況良好，是其莖段增殖的最適培養(yǎng)基。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

生根培養(yǎng)7 d時(shí)，基部開始生根，14 d后大量生根，生根率均為100%。在兩種基本培養(yǎng)基中，隨著添加NAA 濃度的增加，兩個(gè)品種的生根系數(shù)均先增加后減少（表4、表5）。品種‘紫妍’在添加0.2 mg·L－1的NAA 的兩種基本培養(yǎng)基中生根系數(shù)都很高，分別為13.53（MS）和15.50（1／2 MS），且根系多、粗、密集，但后者顯著高于前者（P＜0.05）；品種‘紐9722’在添加0.3 mg·L－1NAA 的1／2 MS培養(yǎng)基中生根系數(shù)達(dá)到最高，為14.87，顯著高于其他處理（P ＜0.05），根系多、粗、密集。所以，品種‘紫妍’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋NAA 0.2 mg·L－1；品種‘紐9722’的最適生根培養(yǎng)基為1／2MS＋NAA 0.3 mg·L－1。

表4 基本培養(yǎng)基添加不同濃度NAA對(duì)兩個(gè)地被菊品種生根的影響Table 4 Effects of NAA in basic mediu m on rooting of t wo C.morif olium cultivars

經(jīng)過煉苗和移栽30 d 后，品種‘紫妍’、‘紐9722’成活率均為100%，且長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1、圖2）。兩個(gè)品種經(jīng)過脫毒、葉片分化、莖段增殖、生根移栽過程，建立起完整的再生體系。

3 討論與結(jié)論

菊花品種的外植體選擇種類較多，多數(shù)研究以葉片和莖段為外植體，獲得了再生率較高的再生體系。相比而言，利用莖段為外植體獲取較為方便，且受強(qiáng)消毒劑影響程度較小，與葉片相比，莖段誘導(dǎo)無菌苗更快捷，周期更短。大量研究證明，0.1%升汞具有良好的消毒效果［13］，但升汞對(duì)環(huán)境有一定的污染，用后必須回收處理，本研究采用2% Na Cl O 溶液進(jìn)行外植體脫毒，效果良好，和馬欣等［14］的研究結(jié)果基本符合，并且環(huán)保無污染?！襄ⅰ~9722’莖段脫毒的最適時(shí)間分別是6、8 min，不同的品種基因型存在差異，植物體本身對(duì)于消毒劑的抗性也不同，葉片的薄厚、莖段的粗細(xì)也有可能是造成最適消毒時(shí)間差異的原因。

在誘導(dǎo)葉片分化不定芽時(shí)，以往多數(shù)研究表明［10，12］，6－BA 和NAA 的組合對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。本研究中，品種‘紫妍’的葉片最適分化培養(yǎng)基 為 MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 1.0 mg·L－1，最高分化率為92.22%，出芽數(shù)為7.60。呂晉慧等［11］的研究也表明品種‘紫妍’在這一激素配比下的分化率最高，為93%，出芽數(shù)為12.4；‘紫妍’在 MS＋6－BA 1.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1時(shí)分化率也很高，本研究與之存在差異，可能是試驗(yàn)季節(jié)、試驗(yàn)環(huán)境條件的不同引起的。通過觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6－BA 濃 度 一 定，NAA 濃 度 較 低（0.2 mg·L－1）時(shí)，愈傷組織雖然出芽率不高，但較為致密、緊實(shí)（圖3 A）。而NAA 濃度在0.5 mg·L－1時(shí)，愈傷組織容易成疏松水漬狀，不定芽也容易玻璃化（圖3B）。原因可能是低濃度NAA 有利于促進(jìn)愈傷組織的形成。而對(duì)于品種‘紐9722’，葉片最高分化率僅為45.59%，沒有成功建立穩(wěn)定的再生體系，通過觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織體積較大，但出芽率過低，而且褐化情況較嚴(yán)重（圖3C），這一問題還需進(jìn)一步研究解決。

圖1 ‘紫妍’再生體系建立的過程Fig.1 The establishment process of‘ziyan’regeneration system

王麗華等［15］研究發(fā)現(xiàn)，過高的6－BA 濃度和過低的NAA 濃度會(huì)使植株的長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰坏珔窃铝恋龋?］的研究表明，6－BA濃度與NAA濃度之比大于10時(shí)，增殖效果最好。本研究表明，‘紐9722’的最適莖段增殖培養(yǎng) 基 是MS＋6－BA 2.0 mg·L－1＋NAA 0.5 mg·L－1，增殖后的無菌苗生長(zhǎng)良好，增殖系數(shù)為10.05，高于之前一些品種的增殖研究，表明不同品種同在最適增殖培養(yǎng)基下，增殖系數(shù)有差異。

圖2 ‘紐9722’再生體系建立的過程Fig.2 The establishment process of‘niu 9722’regeneration system

地被菊較容易生根，多而粗壯的根系有利于植株的移栽成活，使得建立起來的再生體系更加完整。MS培養(yǎng)基是用來繼代無菌苗的常用培養(yǎng)基，既能使幼苗地下部分生根，又能使地上部分健壯生長(zhǎng)。但一般生根培養(yǎng)基為1／2 MS和1／2 MS添加低濃度NAA 或IBA。品種‘早小菊’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋I(xiàn)BA 3.0 mg·L－1［10］，1／2 MS＋NAA 0.1 mg·L－1最適宜品種‘神馬’和‘綠鸚哥’生根［16－17］?？?見，IBA 和NAA 對(duì) 于 不 同 品 種 的 生 根有著不同的影響，主要與基因型有關(guān)。有的研究表明，少量活性炭的添加能夠促進(jìn)生根，如品種‘日本紅’的最適生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋NAA 0.8 mg·L－1＋活性炭1.0 g·L－1［18］。本研究表明，品種‘紫妍’最適生根培養(yǎng)基是1／2 MS＋NAA 0.2 mg·L－1，生根系數(shù)為15.50；品種‘紐9722’最適生根培養(yǎng)基是1／2 MS＋NAA 0.3 mg·L－1，生根系數(shù)為14.87，與大多數(shù)研究基本一致。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度的NAA 會(huì)促進(jìn)根的增粗，但同時(shí)影響了根的增多和伸長(zhǎng)，當(dāng)NAA 濃度大于0.4 mg·L－1時(shí)，能明顯觀察到無菌苗根部切口處褐化、粗大，抑制了根的生長(zhǎng)，導(dǎo)致根發(fā)生畸形，同時(shí)觀察到地上部分生長(zhǎng)緩慢，可能的原因是過高的NAA使根部褐化，抑制了營養(yǎng)從根部向上的運(yùn)輸。

圖3 NAA處理的‘紫妍’和‘紐9722’的愈傷組織形態(tài)Fig.3 The callus mor phological of‘niu 9722’and‘ziyan’treated with NAA

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