羅文彥　成媛　胡藹園　左連富　何麗英

作者單位: 050200石家莊市，河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室(羅文彥、成媛)，組織胚胎學教研室(胡藹園)，人體解剖學教研室(何麗英) ;河北醫(yī)科大學腫瘤研究所(左連富)

食管鱗狀細胞癌中DMBT1和CD44v6的表達及意義

羅文彥成媛胡藹園左連富何麗英

作者單位: 050200石家莊市，河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室(羅文彥、成媛)，組織胚胎學教研室(胡藹園)，人體解剖學教研室(何麗英) ;河北醫(yī)科大學腫瘤研究所(左連富)

【摘要】目的探討食管鱗狀細胞癌組織中抑癌基因DMBT1以及粘附分子CD44v6的表達及與腫瘤生物學行為的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學方法檢測70例食管鱗狀細胞癌組織及23例切緣正常組織中DMBT1、CD44v6的表達情況。結(jié)果DMBT1、CD44v6在癌組織中的表達減弱或呈陰性。DMBT1的表達與食管鱗狀細胞癌組織的分化程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與癌組織的浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。CD44v6的表達與食管鱗狀細胞癌組織的淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與癌組織的分化程度、浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論DMBT1的表達減弱是食管鱗狀細胞癌組織低分化和高度惡性的生物學標志，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CD44v6主要與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】食管鱗狀細胞癌; DMBT1; CD44v6;免疫組織化學

項目來源:河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(編號: 20120271)

E-mail: luowy@126.com

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤患者的重要致死因素。腦惡性腫瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種侯選的抑癌基因，它的突變失活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［1］。CD44v6是一種重要的細胞粘附分子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。我們應(yīng)用免疫組織化學方法檢測食管鱗狀細胞癌中DMBT1、CD44v6的表達，探討DMBT1、CD44v6與食管鱗狀細胞癌生物學行為的關(guān)系，報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料隨機選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科2004年7月至2005年1月經(jīng)手術(shù)切除的食管癌標本70例，其中男37例，女33例;年齡35～78歲，平均年齡(60±7)歲。所有患者術(shù)前均未接受過放療化療及免疫治療。全部病例均經(jīng)病理醫(yī)師檢查證實為食管鱗狀細胞癌，并由兩位年資較高的病理科醫(yī)生，根據(jù)1990年WHO食管癌的分級標準將70例食管鱗狀細胞癌分為高、中、低分化三級，其中高分化鱗癌2例，中分化鱗癌29例，低分化鱗癌15例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例;侵及肌層的鱗癌14例侵及外膜層的鱗癌56例。同時取距腫瘤≥5 cm的正常食管黏膜組織23例作對照。術(shù)后立即取材，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm，共3張，用于常規(guī)HE染色并行組化檢測。

1.2試劑第一抗體DMBT1(H-130) sc-28239兔多克隆抗體由美國Santa Cruz公司出品，CD44v6單克隆抗體和SP-900通用型工作試劑盒均購買于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3染色方法采用免疫組織化學S-P法。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波爐抗原修復。組化染色按S-P試劑盒提供的說明書進行。用已知陽性切片作對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4結(jié)果判斷根據(jù)參考文獻［2］的方法，DMBT1以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒判斷為陽性，對每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1 000個，計數(shù)陽性細胞并計算其所占比例:陽性細胞＜5%，判定為陰性表達，陽性細胞≥5%，判定為陽性表達。根據(jù)參考文獻［3］的方法，CD44v6以細胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞＜10%，判定為陰性表達，陽性細胞≥10%，判定為陽性表達。見圖1、2。

圖1　DMBT1蛋白在高分化鱗癌中的表達，陽性信號定位于細胞漿，角化珠著色明顯(SP法×200)

圖2　CD44v6蛋白在高分化鱗癌中的表達，陽性信號定位于細胞膜(SP法×200)

1.5統(tǒng)計學分析應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1DMBT1、CD44v6在食管黏膜上皮及癌組織的表達DMBT1、CD44v6在23例正常食管鱗狀上皮組織中表達強，在癌組織中表達弱或不表達。

2.2食管鱗狀細胞癌組織中DMBT1的表達與病理特征的關(guān)系DMBT1在癌組織中的表達明顯低于在正常食管鱗狀上皮組織中的表達，隨著分化程度的降低，DMBT1蛋白的表達減弱或不表達(P<0.05)，且DMBT1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

2.3食管鱗狀細胞癌組織中CD44v6的表達與病理特征的關(guān)系CD44v6蛋白的表達與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與食管鱗狀細胞癌的分化程度、浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

2.4食管鱗狀細胞癌中DMBT1與CD44v6的表達與

表1　DMBT1表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系例(%)

表2　CD44v6表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系例(%)

腫瘤的生物學行為70例食管癌中，45例CD44v6表達陽性，25例表達陰性。CD44v6陽性組中DMBT1陽性20例，CD44v6陰性組中DMBT1陽性10例CD44v6陽性組中DMBT1陽性表達率與CD44v6陰性組中DMBT1陽性表達率差別無顯著意義(χ2=0.13 P＞0.05)。見表3。

表3　DMBT1和CD44v6聯(lián)合表達與食管鱗癌的關(guān)系　例

3　討論

DMBT1位于人類染色體10q26.13，為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種候選的抑癌基因，它的表達下調(diào)、缺失、突變失活與多種腫瘤，特別是與上皮細胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度存在明顯的相關(guān)性［1］。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測70例食管癌組織和23例正常食管黏膜上皮組織中DMBT1蛋白的表達，結(jié)果顯示，DMBT1蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯低于正常組織，提示DMBT1基因的失活可能與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)，可能具有抑癌基因?qū)δ[瘤負性調(diào)控的作用;本研究還發(fā)現(xiàn)低分化的癌組織DMBT1的陽性表達率顯著低于高分化的癌組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織DMBT1蛋白的陽性表達率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這說明DMBT1表達的減弱與食管鱗癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度都是影響腫瘤預后的因素，因此提示DMBT1在食管鱗癌中可能具有判斷預后的價值。

腫瘤轉(zhuǎn)移作為一個相當復雜的過程，不僅與多個癌基因與抑癌基因的改變有關(guān)，還與腫瘤細胞的粘附性有關(guān)，CD44s是一種細胞表面的跨膜糖蛋白粘附分子，其細胞膜區(qū)羧基端通過錨蛋白、埃茲蛋白、膜突蛋白、根蛋白與細胞骨架肌動蛋白相連［4］，細胞膜外區(qū)有透明質(zhì)酸、膠原、纖維連接素、硫酸軟骨素的結(jié)合點［5］，CD44s通過細胞膜外受體與相應(yīng)配體的結(jié)合參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間特異性粘附過程，另外它還參與淋巴細胞歸巢，參與淋巴細胞的激活，以及參與信號轉(zhuǎn)導等功能［6，7］。CD44v6的結(jié)構(gòu)與CD44s的基本結(jié)構(gòu)相似，但在細胞膜外靠近細胞膜區(qū)插入了43個由v6變異拼接型外顯子所編碼的不同序列的氨基酸［8］。近年來發(fā)現(xiàn)CD44與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果表明CD44v6蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯低于正常組織，說明CD44v6表達下降在食管磷癌的發(fā)生中可能有一定的作用;本研究還發(fā)現(xiàn)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織CD44v6蛋白的陽性表達率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明CD44v6表達的減弱與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)對控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用，進入循環(huán)的腫瘤細胞必須逃逸機體的免疫監(jiān)視殺傷系統(tǒng)，才能得以在繼發(fā)器官定位生長。DMBT1編碼蛋白是SRCR超家族中的新成員，SRCR超家族是免疫球蛋白超家族中具有回憶功能且大多數(shù)與免疫系統(tǒng)的增生和分化相關(guān)的家族［9－11］。DMBT1SAG(salivary agglutinin)、DMBT1GP340(glycoprotein-340)二者都是DMBT1的剪接形式［12］，分別存在于口腔、呼吸道中，與免疫防御、上皮再生有關(guān)。Mollenhauer等［13］研究發(fā)現(xiàn)，DMBT1GP340通過與肺泡表面活性蛋白Sp-D (surfactant protein D)、Sp-A作用可刺激肺泡巨噬細胞的遷移。Sp-D、Sp-A已從人類支氣管肺泡灌洗液中分離，存在于肺泡巨噬細胞，可誘導肺泡巨噬細胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn)無論是正常食管粘膜組織還是食管鱗癌組織，其間質(zhì)中的巨噬細胞和淋巴細胞DMBT1的表達均為強陽性，而CD44v6有參與淋巴細胞的歸巢和參與淋巴細胞的激活的作用［6，7］，但DMBT1和CD44v6在免疫系統(tǒng)中的作用是否具有相關(guān)性還不明確。

與DMBT1相同基因的選擇性拼接的兔的hensi蛋白，能夠誘導微絨毛蛋白的表達，而導致尖端終端網(wǎng)狀蛋白(細胞角蛋白19和肌動蛋白)的出現(xiàn)［14］CD44s細胞膜區(qū)羧基端通過錨蛋白、埃茲蛋白、膜突蛋白、根蛋白與細胞骨架肌動蛋白相連［4］，但DMBT1蛋白與CD44v6的關(guān)系還不明確。目前也沒有DMBT 和CD44v6相互關(guān)系的報道，本研究中雖然DMBT1和CD44v6的表達并無相關(guān)性，但都與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此DMBT1和CD44v6可共同作為判斷食管鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移和預后的指標。

參考文獻

1Mollenhauer J，Wiemann S，Scheurlen W，et al.DMBT1，a new member the SRCR superfamily，on chromosome 10q25.3-26.1 is deleted in ma lignant brain tumors.Nat Genet，1997，17: 32-39.

2Sasaki M，Huarg SF，Chen MF，et al.Expression of deleted in malignan brain tumor-1 (DMBT1) molecule in biliary epithelium is augmented i hepatolithiasis: Possible participation in lithogenesis.Digestive Disease and Sciences，2003，48: 1234

3陳海霞，武培敬，許艷梅，等.CD44v6、EGFR及nm23-H1基因蛋白在食管鱗癌組織中的表達及意義.腫瘤防治研究，2003，30: 388-390.

4Tsakita S，Oishi K，Sato N，et al.ERM family members as molecular link ers between the cell surface glycoprotein CD44 and actin-based cytoskele tons.J Cell Biol，1994，126: 391-401.

5Stamenkovic I，Amiot M，Pesando JM，et al.A lymphocyte molecule impli cated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein fam ily.Cell，1989，56: 1057-1062.

6Toly C，Hofmann M，Herrlich P，et al.Splicing choice from ten variant ex on establishs CD44 variability.Nuc Acids Rea，1993，21: 1225.

7Haynes BF，Telen MJ，Hale LP，et al.CD44-a molecule involved in leu kocyte adherence and T-cell activation.Immunol Today，1989，10: 423.

8Underhill CB，Gress SJ，Tarone P.The hyaluronate receotor is identical t a glycoprotein of Mr 85000(gp85) as show by a monoctonal antibody th interferes with binding activity.J Biol Chem，1987，262: 1312-1314.

9Rasheed BK，Mclendon RE，F(xiàn)iredman HS，et al.Chromosome 10 deletio mapping in human gliomas: a common deletion region in 10q 25.Onco gene，1995，10: 2243-2246.

10Uurich A，Sures I，Degidio M，et al.The secreted tumor-associated anti gen 90k is a potent immune stimulator.J Biol Chem，1994，269: 18401 18407.

11Law SK，Mickem KJ，Shaw JW，et al.A new macrephage differentiatio antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily.Eur Immunol，1993，23: 2320-2325.

12Bikker FJ，van der Wal JE，ligtenberg AJ，et al.Salivary agglutinin DMBT1SAG expression is up regulated in the presence of salivary glan tumors.J Dent Res，2004，83: 567-571.

13Mollenhauer J，Herbertz S，Holmskov U，et al.DMBT1 encodes a protei involved in the immune defense and in epithelial differentiation andi highly unstable in cancer.Cancer Res，2000，60: 1704-1710.

14Al-Awqati Q，Vijayakumar S，Takito J，et al.Phenotypic plasticity an terminal differentiation of the intercalated cell: the hensin pathway.Ex Nephrol，2000，8: 66-71.

Expression and biological significance of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma

LUO Wenyan*， CHENG Yuan*，HU Aiyuan，et al.*
Department of Pathology，College of Basic Medicine of Hebei TCM College，Shijiazhuang 050200，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma，and to explore the correlation between their expressions and the biological behavior of tumors.Methods The expression levels of DMBT1 and CD44v6 were detected by immunohistochemistry (IHC) in 70 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 23 cases of incisal margin normal tissues.Results The expression levels of DMBT1 and CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma were decreased or negative.The expression levels of DMBT1 were related with histological differentiation degree，lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (P<0.05)，however，which were not associated with infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).The expression levels of CD44v6 were correlated to lymph node metastasis (P ＜0.05)，however，which were not related with histological differentiation degree and infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).ConclusionThe decrease of DMBT1expression may be the biological markers of poor differentiation and higher malignancy degree of esophageal squamous cell carcinoma tissue，moreover，which is closely correlated to lymph node metastasis of tumor.The expression levels of CD44v6 are related with the pathogenesis and lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

【Key words】esophageal squamous cell carcinoma; DMBT; CD44v6; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－27

通訊作者:左連富，050051河北醫(yī)科大學腫瘤研究所;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.002

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1290－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 735.1