張愛(ài) 項(xiàng)菲

（麻陽(yáng)縣食品藥品監(jiān)督管理局，湖南 麻陽(yáng) 419400）

補(bǔ)腎丸定性定量方法研究

張愛(ài) 項(xiàng)菲

（麻陽(yáng)縣食品藥品監(jiān)督管理局，湖南 麻陽(yáng) 419400）

目的：建立補(bǔ)腎丸的定性定量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用薄層色譜法（TLC）對(duì)鎖陽(yáng)、白芍及黃柏進(jìn)行定性鑒別；用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定補(bǔ)腎丸中熟地黃的含量，采用Dikma Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果：TLC能明顯檢出鎖陽(yáng)、白芍及黃柏特征斑點(diǎn)，無(wú)陰性藥材干擾。毛蕊花糖苷進(jìn)樣量在5.08～81.28 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 44，平均回收率為98.72%，RSD=0.82%。結(jié)論：定性、定量方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能有效控制補(bǔ)腎丸的內(nèi)在質(zhì)量。

補(bǔ)腎丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；毛蕊花糖苷

補(bǔ)腎丸是由鎖陽(yáng)、枸杞子、白芍、五味子及熟地黃等10味中藥制成的復(fù)方制劑，具有鎖陽(yáng)固精，滋陰補(bǔ)腎的功效，廣泛應(yīng)用于腎水不足，陰虛陽(yáng)亢，頭暈咳嗽，腰膝酸痛，夢(mèng)遺滑精等病癥。熟地黃為方中君藥，其有效成分為毛蕊花糖苷。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（第二冊(cè)），只有顯微鑒別，為了保證該藥品質(zhì)量的穩(wěn)定有效，本研究參考資料文獻(xiàn)，對(duì)制劑中的鎖陽(yáng)、白芍及黃柏進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)制劑中熟地黃中所含的毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定。建立了方法可靠、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法，提升了該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

美國(guó)安捷倫 1260高效液相色譜儀（Agilent 1260四元泵，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)）；CBL9960A超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；日本島津AUW220D電子分析天平（十萬(wàn)分之一）；毛蕊花糖苷（批號(hào)：111530-200706）、熊果酸（批號(hào)：110742-200516）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201337）、黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-200703）、鹽酸黃柏堿（批號(hào)：111895-201202），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；補(bǔ)腎丸（呼倫貝爾松鹿制藥有限公司，6 g/丸，批號(hào)：130708，131119，140322，140603）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 薄層定性鑒別

2.1 鎖陽(yáng)

取本品6 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加乙醇 60 mL，超聲處理 30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取缺鎖陽(yáng)的陰性樣品，同法制備成陰性對(duì)照溶液。再取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄 ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL，對(duì)照品溶液4 μL及陰性對(duì)照溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)13 cm取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1）。

2.2 白芍

圖1 鎖陽(yáng)TLC圖

取本品 10 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加乙醇 60 mL，超聲處理 30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上濃縮至1 mL，加適量中性氧化鋁，拌勻，干燥，加在中性氧化鋁柱（100目，4 g，內(nèi)徑為1 cm），用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺白芍的陰性樣品，同法制備成陰性對(duì)照溶液。再取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（TLC）（《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述 3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖2）。

圖2 白芍TLC圖

2.3 黃柏

取本品6 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加1%醋酸甲醇溶液50 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取缺黃柏的陰性樣品，同法制備成陰性對(duì)照溶液。再取黃柏對(duì)照藥材0.2 g，加1%醋酸甲醇20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸黃柏堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含 0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖3）。

圖3 黃柏TLC圖

3 熟地黃的含量測(cè)定

3.1 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，混勻，取約3 g，精密稱定，加入硅藻土3 g，研勻，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min（功率250 W，頻率50 kHz），取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2 陰性樣品溶液的制備

取除去熟地黃以外的其他藥材，按供試品制備方法“3.1”項(xiàng)下方法制成陰性溶液。

3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的毛蕊花糖苷對(duì)照品10.16 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度為101.6 μg/mL）；精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得（濃度為10.16 μg/mL）。

3.4 色譜條件

Dikma Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；進(jìn)樣量：20 μL。 理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

3.5 專屬性試驗(yàn)

照“3.4”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，在毛蕊花糖苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性液在此峰位無(wú)吸收，對(duì)本品中毛蕊花糖苷含量測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖4。

圖4 補(bǔ)腎丸HPLC圖

3.6 線性范圍考察

精密吸取 “3.3”項(xiàng)下濃度為101.6 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL至 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，按“3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，計(jì)算回歸方程，毛蕊花糖苷回歸方程為：

Y=3 095.5X－2 799.1。

r=0.999 44，毛蕊花糖苷進(jìn)樣量在5.08～ 81.28 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品（批號(hào)：140603）溶液10 μL，注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定各次峰面積，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.76%。結(jié)果表明該色譜系統(tǒng)具有較好的精密度。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：140603）溶液，分別在 0，4， 6，8，12，24 h，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.91%。表明樣品溶液在所考察時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)：140603），精密稱取6份，按供試品測(cè)定項(xiàng)下方法操作，重復(fù)測(cè)定6次，毛蕊花糖苷平均含量為 0.331 0 mg/丸，RSD為 0.75%。表明該方法重現(xiàn)性好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知毛蕊花糖苷含量（批號(hào)：140603，毛蕊花糖苷含量0.331 0 mg/丸）的供試品約1.5 g共 9份，分別精密加入濃度為101.6 μg/mL毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液 0.8，0.8，0.8，1.0，1.0，1.0，1.2，1.2， 1.2 mL，按供試品溶液制備方法操作，測(cè)定加標(biāo)樣品中的毛蕊花糖苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.11 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的樣品，按供試品測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)定毛蕊花糖苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 經(jīng)過(guò)不斷摸索試驗(yàn)，制定了鎖陽(yáng)、白芍及黃柏的鑒別方法，該方法特征斑點(diǎn)明顯，色譜分離清晰，可作為補(bǔ)腎丸中鎖陽(yáng)、白芍及黃柏的專屬性鑒別。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4.2 本試驗(yàn)樣品處理方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效控制本制劑的質(zhì)量，對(duì)保證制劑質(zhì)量有著重要意義。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005：79-95.

[3] 徐燦輝，何維為，何云飛.HPLC法測(cè)定六味地黃膠囊中的毛蕊花糖苷、馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37（3）：257-259.

[4] 李偉，龍書(shū)可，劉輝，等.口服清新泡騰片定性定量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中南藥學(xué)，2010，8（6）：410-412.

[5] 陳天朝，瞿來(lái)超.HPLC法同時(shí)測(cè)定地黃中梓醇與毛蕊花糖苷的含量 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（5）：105-107.

[6] 宋子榮，譚梓駿，陳百松，等.地黃提取工藝的優(yōu)化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12（1）：8.

[7] 陳傳福，張培正.兩種不同提取熟地黃多糖工藝研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2008，8（11）：852-854.

[8] 郭曉玲，韓亮，馮毅凡，等.瑤族醫(yī)藥風(fēng)濕骨痛酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥，2007，29（3）：386-389.

[9] 宗凱，熊苗苗，謝委，等.胃腸康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（1）：92-94.

Study on the Methods for Qualitative and Quantitative Control of Bushen Pills

Zhang Ai，Xiang Fei（Food and Drug Administration Bureau of Mayang County，Hunan Mayang 419400,China）

Objective:To establish the standards for qualitative and quantitative control of Bushen pills.Methods:TLC was used to identify quantitatively Cynomorium songaricum Rupr,Paeoniae radix alba and Phellodendri chinensis cortex.The content of Radix Rehmanniae Praeparata in Bushen pills was determined by HPLC.Dikma Diamonsil column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）was adopted with a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid（16∶84）at a flow rate of 1.0 mL/min,the column temperature was at 35℃,the detection wavelength was at 334 nm and the sample size was 20 μL.Results:The feature spots of Cynomorium songaricum Rupr,Paeoniae radix alba and Phellodendri chinensis cortex can be detected by TLC without interference of negative materials.A good linear relationship of acteoside was obtained within the range of 5.08～81.28 μg（r=0.999 44）.The average recovery was 98.72%with RSD of 0.82% （n=6）.Conclusion:The method is simple，accurate and reproducible and can be used for the effective control of the internal quality of Bushen pills.

Bushen Pills；Quality Standards；TLC；HPLC；Acteoside

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.08.004

2015-04-22）

張愛(ài)，女，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail:569997073@qq.com

項(xiàng)菲，女，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：1115844935@qq.com