張亦鳴，謝晶，薛斌，周冬香，邵則淮，胡月華，孫濤

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工儲(chǔ)藏工程研究中心，上海，201306)

木糖是一種廣泛存在于自然界的植物纖維素，由木糖分子以β-1，4糖苷鍵連接而成［1］。它具有低熱量、改善人體的微生物環(huán)境，提高機(jī)體免疫力的功效［2-5］。作為木糖的寡聚糖，低聚木糖(xylo-oligosaccharide，XO)由 2 ～7 個(gè)木糖分子結(jié)合而成［6］，它可增加腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量，對(duì)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有吞噬能力，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力［7-9］。此外，低聚木糖可顯著降低血壓、血清膽固醇，并有效控制血糖水平，具有非常高的醫(yī)療保健價(jià)值。

化學(xué)改性是賦予多糖活性的重要手段［10-11］，但往往會(huì)引入雜質(zhì)和副產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是伴隨著食品加工、生產(chǎn)、貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的反應(yīng)，是一種安全可靠的多糖改性手段［12-13］。

作為潛在的食品保鮮劑，木糖-殼聚糖美拉德共聚物［3］具有良好的抗菌性、抗氧化性;木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物［4］具有很好的Fe2+螯合能力，可降低油脂過(guò)氧化值(POV);在半干面中添加0.35%木糖-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物［5］，其貨架期可延長(zhǎng)7 d。具有上述活性的為木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其中包含小分子醛酮類等易揮發(fā)物質(zhì)，而以美拉德反應(yīng)為改性手段，對(duì)其衍生物的活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系研究還較為罕見(jiàn)。

本文以美拉德反應(yīng)為改性手段，制備低聚木糖美拉德衍生物，考察其抗氧化能力，為低聚木糖化學(xué)改性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低聚木糖(≥95%)，生化級(jí)，購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司;魯米諾、DPPH，Sigma公司;其余試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司?？寡趸瘻y(cè)試所需溶液，由二次蒸餾水配制。

WFZ UV2000型紫外分光光度計(jì)(上海合利儀器有限公司);島津RF-530 PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);Delta 320型 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀分析儀器上海有限公司);FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司);IFFM-D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁科技有限公司);METTLER AE200型電子分析天平;JI80-2B型臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 低聚木糖美拉德反應(yīng)衍生物的制備

稱取低聚木糖10.0 g，加入7.7 g脯氨酸，使得羰基和氨基的摩爾質(zhì)量比為1∶1，用100 mL的二次蒸餾水溶解，在100℃條件下冷凝回流反應(yīng)。監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中pH、吸光度以及熒光值的變化，并用丙酮分離提取5、15和30 h低聚木糖美拉德衍生物，記為XP-5h、XP-15h 和 XP-30h。

1.3 測(cè)試表征

紅外光譜在FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行，采用KBr壓片法制樣，測(cè)定波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1。

產(chǎn)物的相對(duì)平均分子質(zhì)量及其分布采用GPC法測(cè)定。GPC測(cè)試條件如下:流動(dòng)相:0.2 mmol/L醋酸鈉和醋酸緩沖溶液，pH4.80;監(jiān)測(cè)器:Waters 2410示差折光監(jiān)測(cè)器;柱子:TOSOH BIOSEP TSKGelG4000SWXL:溫度:40℃;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為:葡聚糖，(分子質(zhì)量:473 000、188 000、76 900、43 200、10 500、4 440 Da)。

1.4 抗氧化性能測(cè)定

1.4.1 對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除作用［14］

在裝有2.0 mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液的比色管中，加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL，搖勻，33℃避光靜置0.5 h，在517 nm處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無(wú)水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。

清除率/%=(1-(Ai-Aj)/A0)×100

1.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用［15］

1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液用0.05 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液(pH10.20)配制，0.1 mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液用1×10-3mol/L的HCl配制，使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。使用緩沖液作為溶劑，配制不同濃度的樣品溶液。采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀來(lái)測(cè)定樣品溶液的峰面積，具體如下:蠕動(dòng)泵分別泵入魯米諾、緩沖溶液以及鄰苯三酚，在流通池中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，記錄發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，以峰面積定量。經(jīng)SOD、過(guò)氧化氫酶以及甘露醇檢測(cè)，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子O2-·。

式中:A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。

1.4.3 還原能力的測(cè)定［16］

取2.0 mL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.60)和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻后在3 000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，靜置10min后在700 nm處測(cè)定吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值。兩組間比較采用t檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值的變化

低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中的pH變化如圖1所示。反應(yīng)體系的初始pH呈弱酸性，隨著反應(yīng)的推進(jìn)，反應(yīng)物pH逐漸降低，說(shuō)明反應(yīng)中生成羥甲基糠醛等酸性物質(zhì)，這與文獻(xiàn)中的結(jié)論一致［17］。

2.2 UV-Vis吸光度的變化

美拉德反應(yīng)中期，會(huì)生成無(wú)色小分子中間體，如:Amadori重排產(chǎn)物裂解的丙酮醛、丁二酮、丙酮醇等，以及它們?cè)赟trecker降解后生成的小分子醛類，這些中間體在295 nm處有紫外吸收;其后反應(yīng)物經(jīng)過(guò)環(huán)化、降解、縮合等，形成褐色產(chǎn)物，在420 nm處有可見(jiàn)光吸收［18］。紫外-可見(jiàn)吸收值越高，美拉德反應(yīng)就越充分，由此可衡量反應(yīng)的進(jìn)程。圖2為低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中紫外-可見(jiàn)吸光度的變化。由圖可知，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，295 nm處紫外吸收增加，說(shuō)明反應(yīng)中生成了越來(lái)越多的小分子醛類物質(zhì);在440 nm處的可見(jiàn)光吸收值也在增加，反應(yīng)物褐色程度加深。

2.3 熒光值的變化

由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，如:羧甲基賴氨酸、戊糖苷素、精氨嘧啶等，具有自發(fā)熒光的特性，當(dāng)受到300～420 nm的入射光激發(fā)后，在420～600 nm會(huì)產(chǎn)生熒光光譜［19］，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其熒光光譜特征不同。圖3為低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中，在激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm處熒光值的變化。由圖可知，隨著反應(yīng)推進(jìn)，熒光值增加，說(shuō)明反應(yīng)中生成了越來(lái)越多的熒光物質(zhì)。

2.4 低聚木糖美拉德產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

圖4為低聚木糖、脯氨酸及其美拉德反應(yīng)衍生物的紅外譜圖。低聚木糖在3 413 cm-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 923 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 636 cm-1處的吸收峰是-OH的彎曲振動(dòng)吸收峰，而在1 032 cm-1處的吸收峰，則是醇羥基的變角振動(dòng)吸收峰，在892 cm-1處存在型糖苷鍵的特征吸收峰，與文獻(xiàn)相符［2］;脯氨酸在3 433 cm-1處的吸收峰是水分子-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，3 062 cm-1處的吸收峰為-NH2+的N-H伸縮振動(dòng)峰，1 623 cm-1為羧基中C-O雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，而1 380 cm-1處為羧基中C-OH中C-O單鍵的伸縮振動(dòng)。美拉德反應(yīng)后的衍生物c，d，e保留了低聚木糖2 923 cm-1處C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 032 cm-1處醇羥基的變角振動(dòng)吸收峰，以及892 cm-1附近的多糖特征吸收帶;而脯氨酸3 062 cm-1處的-NH2+的N-H伸縮振動(dòng)峰消失，說(shuō)明反應(yīng)部位在此處;衍生物保留了脯氨酸的1 623 cm-1峰和1 380 cm-1峰，說(shuō)明衍生物中含有羧基。

GPC法測(cè)得低聚木糖的相對(duì)分子質(zhì)量為3 879，低聚木糖衍生物XP-5h、XP-15h和XP-30h的相對(duì)分子質(zhì)量為3 925、4 044和4 071，衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量都有所增加，且隨著反應(yīng)時(shí)間增加，分子質(zhì)量逐漸增大，表明低聚木糖分子中的羰基與脯氨酸的游離氨基反應(yīng)，生成了更大的分子。

2.5 對(duì)DPPH·的清除

DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于定量測(cè)定生物試樣和食品的抗氧化能力［20］。DPPH·在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，其單電子被結(jié)合而使其顏色減褪，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度減小，減小的程度與清除劑的清除能力及其數(shù)量呈定量關(guān)系。圖5描述了低聚木糖衍生物對(duì)DPPH·的清除能力。由圖5可知，XP-30h，XP-15h和XP-5h的IC50(對(duì)自由基清除率為50%時(shí)所需要的自由基清除劑濃度)分別為0.046、0.080和0.085 mg/mL，衍生物對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)閄P-30h＞XP-15h＞XP-5h，即隨著反應(yīng)進(jìn)行，低聚木糖美拉德反應(yīng)衍生物對(duì)DPPH·的清除能力逐漸增強(qiáng)。茶多酚TP對(duì)照組對(duì)DPPH·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低聚木糖衍生物，濃度大于0.005 mg/mL茶多酚對(duì)DPPH·的清除能力幾乎為100%。由于低聚木糖XO幾乎對(duì)DPPH·無(wú)清除能力，而美拉德反應(yīng)后的低聚木糖衍生物對(duì)DPPH·的清除能力顯著提升，說(shuō)明美拉德反應(yīng)是賦予低聚木糖強(qiáng)抗氧化性的有效手段，這可能與美拉德反應(yīng)過(guò)程中生成羰基類物質(zhì)有關(guān)，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.6 對(duì)O2-·的清除

O2-·是一類較毒的活性氧自由基，由多種生物反應(yīng)和光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，它還能分解形成更強(qiáng)的活性氧物質(zhì)，如單線態(tài)氧和羥自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化［21］。圖6描述了低聚木糖衍生物清除O2-·的能力，XP-30h、XP-15h、XP-5h對(duì) O2-·半抑制濃度 IC50分別為0.581、0.618和1.199 mg/mL，即對(duì) O2-·清除能力為:XP-30h＞XP-15h＞XP-5h，略低于茶多酚TP對(duì)照組(IC50為0.387m g/mL)，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低聚木糖(IC50為4.260 mg/mL)，這與上述DPPH·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.7 還原能力的測(cè)定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系［22］。如圖7所示，在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，XP-30h、XP-15h和XP-5h的吸光度分別為1.205、1.198和0.994，還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)閄P-30h≈XP-15h＞XP-5h;對(duì)照組茶多酚TP在濃度為0.5 mg/mL時(shí)的吸光度為1.496，高于低聚木糖衍生物。而低聚木糖幾乎無(wú)還原能力，說(shuō)明美拉德反應(yīng)后的衍生物還原能力得到顯著提升，這與上述DPPH清除實(shí)驗(yàn)和O2-·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以美拉德反應(yīng)為改性手段，制備低聚木糖衍生物，并考察其對(duì)DPPH·和O-2·的清除能力，以及還原能力。結(jié)果表明，低聚木糖衍生物的抗氧化性均大大提升，故可以認(rèn)為美拉德反應(yīng)是低聚木糖改性的有效手段，且隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，衍生物的抗氧化性越來(lái)越強(qiáng)，但相關(guān)機(jī)理還待進(jìn)一步研究。本研究為運(yùn)用天然多糖制備安全、高效的抗氧化劑提供了很好的思路。

［1］ Barakat A，Kadimi A，Steyer J P.et al.Impact of xylan structure and lignine xylan association on methane production from C5-sugars ［J］.Biomass and Bioenergy，2014，63:33-45.

［2］ WU Shuping，HU Jiao，WEI Liuting，et al.Antioxidant and antimicrobial activity of Maillard reaction products from xylan with chitosan/chitooligomer/glucosamine hydrochloride/taurine model systems ［J］.Food Chemistry，2014，148:196-203.

［3］ LI Xiaoxiu，SHI Xiaowen，WANG Miao，et al.Xylan chitosan conjugate-A potential food preservative［J］.Food Chemistry，2011，126(2):520-525.

［4］ 于彭偉，劉登勇，周光宏.木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系光譜特性和抗化氧性能的研究［J］.食品科學(xué)，2012，33(1):54-58.

［5］ ZHU Kexue，LI Jie，LI Man，et al.Functional properties of chitosan-xylose Maillardreactionproducts and their application to semi-dried noodle ［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92(2):1 972-1 977.

［6］ Madhukumar M S，Muralikrishna S.Structural characterisation and determination of prebiotic activity of purifiedxylooligosaccharides obtained from Bengal gram husk(Cicerarietinum L.)and wheat bran(Triticumaestivum)［J］.Food Chemistry，2010，118(2):215 – 223.

［7］ 凌沛學(xué)，朱希強(qiáng)，蘇移山，等.低聚木糖功能與應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 食品與藥品，2007，9(9):35-39.

［8］ Moure A，Gullon P，Dominguez H，et al.Advances in the manufacture，purification and applications of xylo-oligosac-charides as food additives and nutraceuticals［J］.Process Biochemistry，2006，41:1 913-1 923.

［9］ Carvalho A F A，Neto P O，Silva D F，et al.Xylo-oligosaccharides from lignocellulosic materials Chemical structure，health benefits and production by chemical and enzymatic hydrolysis［J］.Food Research International，2013，51(1):75-85.

［10］ MA Li-shuai，CHEN Hai-xia，ZHANG Yu，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus［J］.Carbohydrate Polymers，2012，89(2):371-378.

［11］ Singh V，Kumar P，Sanghi R.Use of microwave irradiation in the grafting modification of the polysaccharides-A review［J］.Progress in Polymer Science，2012，37(2):340-364.

［12］ 孫濤，陳春紅，謝晶.基于與木糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2011，23(2):219-223.

［13］ 王惠英，孫濤，周冬香，等.殼聚糖的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(10):91-93.

［14］ 許剛.紅薯中黃酮提取及抗氧化研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(4):22-27.

［15］ 姚倩，孫濤，徐軼霞.低聚殼聚糖衍生物的制備及其抗氧化性能［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2008，(3):530-533.

［16］ YEN G C，CHEN Hui-yin.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43(1):27-32.

［17］ 鄭文華，許旭.美拉德反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展，2005，17(1):122-129.

［18］ YU Xiang-ying，ZHAO Ming-yue，HU Jun，et al.Correspondence analysis of antioxidant activity and UV-Vis absorbance of Maillard reaction products as related to reactants［J］.LWT-Food Science and Technology，2012，46(1):1-9.

［19］ Bosch L，Alegria A，F(xiàn)arre R，et al.Fluorescence and color as markers for the Maillard reaction in milk-cereal based infant foods during storage ［J］.Food Chemistry，2007，105(3):1 135-1 143.

［20］ Blois M S.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，2002，26(4):1 199-1 200.

［21］ Virginia J F，Yuan-Hsu K，David E M，et al.Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox ［J］.Free Radic Biol Med，1994，16(6):675-684.

［22］ Duh P D，Du P C，Yen G C.Action of methanolic extract of mung bean bulls as inhibitions of lipid peroxidation and non-lipid oxidative damage ［J］.Food Chemial Toxicol，1999，37(11):1 055-1 059.