王爽，張巖，王贊，李永波，章晶晶，馬超峰，周巍，2

1(河北省食品檢驗研究院河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊，050071)

2(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定，071000)

納他霉素(Natamycin)是一種主要由納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chattanoogensis)和褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)等產(chǎn)生菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的一種二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［1］。納他霉素能抑制真菌、防止真菌毒素的產(chǎn)生，很難被人體消化道吸收，對人體無致癌、致畸、致突變和致敏作用。納他霉素溶解度很低，既不會影響食品中的其他成分，也不會影響食品風(fēng)味，目前作為一種天然、廣譜、高效、安全的食品防腐劑，已在世界30多個國家廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、發(fā)酵酒、飲料和果汁等食品的生產(chǎn)和保藏［2］。

目前納他霉素的在國際市場上需求數(shù)量巨大，但國內(nèi)發(fā)酵水平較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本太高，這嚴重制約了納他霉素在食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用。目前許多研究機構(gòu)通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)菌株［3］、發(fā)酵培養(yǎng)基［4］、發(fā)酵培養(yǎng)條件［5］、添加前體物質(zhì)［6-7］等方法提高納他霉素的產(chǎn)量。

在常規(guī)液態(tài)發(fā)酵體系中加入一種新的液相，以減少氣液之間傳氧阻力，提高底物溶氧能力［8］。這種液相一般具有比水更高的溶氧量，且與發(fā)酵液不互溶，稱為氧載體(oxygen vectors)。氧載體發(fā)酵體系具有氧傳遞速度快、能耗低、氣泡生成少、剪切力小等特點，常用的氧載體有烷烴類化合物、氟碳化合物、植物油和表面活性劑等。目前烷烴類氧載體對那他霉素發(fā)酵的影響鮮有報道，因此本文選用實驗室常見且價格低廉的的正己烷、正十二烷和正十六烷作為氧載體，研究其對納他霉素生物合成的影響，具有重要的理論和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實驗菌株:褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC 13326，購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

斜面保存/平板分離培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母粉3，麥芽浸粉3，瓊脂粉15，蒸餾水1 L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉6，NaCl 10，蒸餾水 1 L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)(YEME，酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母粉3，麥芽浸粉3，MgCl2·6H2O 1.05，蒸餾水 1 L，pH 7.0。

主要試劑:酵母粉、蛋白胨、麥芽浸粉、瓊脂、葡萄糖均為生化級試劑，NaOH、NaCl、無水甲醇、正己烷、正十二烷、正十六烷均為分析純，納他霉素標準品購自Sigma公司。

儀器與設(shè)備:BS-124S型電子天平，北京賽多利斯公司;ES2315高壓蒸汽滅菌器，日本 TOMY公司;HWY 22112型恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;DH-101-2型電熱鼓風(fēng)干熱箱，天津市中環(huán)試驗公司;UV2550雙光束紫外可見分光光度計，日本島津SHIMADZU。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)方法

將1環(huán)試管斜面菌種接入50 mL種子培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h;然后取1 mL種子液加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)96 h。納他霉素含量和菌體細胞干重(cell dry weight，CDW)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 樣品處理

取1.0 mL發(fā)酵液于離心管中，加入9.0 mL無水甲醇，振蕩器充分振蕩后于4 000 r/min離心15 min，除去菌絲體及培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，所得上清液用無水甲醇適當稀釋后即為待測液。

1.2.3 菌體細胞干重(CDW)的測定

發(fā)酵液培養(yǎng)96 h后，用移液管吸取40 mL，經(jīng)過漏斗過濾，收集菌體，用去離子水洗滌3次，濾紙105℃烘干24 h至質(zhì)量恒定，以空白濾紙質(zhì)量為對照，稱量并計算菌體細胞干重。

1.2.4 紫外分光光度法測定納他霉素

配制一定濃度梯度的納他霉素標準溶液，用UV-2550雙光束紫外可見分光光度計測定其在303.0 nm的吸光度。以納他霉素標準溶液濃度X為橫坐標，303.0 nm處的吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線。測定按照1.3.2得到的待測液，測定其在303 nm的吸光度，代入標準曲線，計算得到待測液中納他霉素的含量。以未添加氧載體的發(fā)酵液中納他霉素含量為基準，計算添加氧載體的發(fā)酵液中納他霉素的相對含量。

1.2.5 氧載體添加實驗

1.2.5.1 褐黃孢鏈霉菌對氧載體的可利用性

將種子培養(yǎng)液離心，用無菌水沖洗3次，收集不含培養(yǎng)基成分的菌體，加入無菌水配成一定濃度的菌懸液。正己烷、正十二烷和正十六烷通過0.22 μm濾膜過濾除菌。將制備的菌懸液以體積分數(shù)10%的接種量接入無碳源培養(yǎng)基(對照組)以及添加體積分數(shù)3%氧載體的培養(yǎng)基(實驗組)，搖床發(fā)酵培養(yǎng)。取等體積對照組和實驗組培養(yǎng)液比較細胞干重。

1.2.5.2 氧載體添加濃度影響實驗

正己烷、正十二烷或正十六烷通過0.22 μm濾膜過濾除菌，在發(fā)酵初始階段按0%、3%、6%、9%、12%的體積分數(shù)添加在裝液量為50 mL/250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)96 h。測定菌體細胞干重(CDW)和納他霉素含量。

1.2.5.3 氧載體添加時間影響實驗

正己烷、正十二烷或正十六烷通過0.22 μm濾膜過濾除菌，按各氧載體的最優(yōu)添加濃度，分別在發(fā)酵后0、24、48和72 h添加在裝液量50 mL/250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)96 h。測定菌體細胞干重(CDW)和納他霉素含量。

1.2.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)和鄧肯氏多重檢驗(P＜0.05)。

2 結(jié)果及分析

2.1 褐黃孢鏈霉菌對氧載體的可利用性

有機試劑作為氧載體用于微生物好氧發(fā)酵的前提是不能作為碳源被細菌利用，考察褐黃孢鏈霉菌對液態(tài)烷烴的可利用性，以確定正己烷、正十二烷、正十六烷能否作為碳源供細胞生長。

如圖1所示，對照組和實驗組菌體濃度基本相等(P＜0.05)，說明實驗所用褐黃孢鏈霉菌不以烷烴類物質(zhì)作為碳源生長繁殖。因此液態(tài)烷烴類物質(zhì)作為氧載體用于納他霉素發(fā)酵，這與楊秋艷等人的研究結(jié)果一致［9］。

2.2 氧載體添加濃度的影響

2.2.1 正己烷添加量的影響

如圖2所示，在體積分數(shù)為0～12%的添加范圍內(nèi)，菌體細胞干重和納他霉素含量的變化趨勢基本一致。隨著正己烷的添加量的增加，菌體細胞干重和納他霉素含量都顯著增加(P＜0.05)，在添加的體積分數(shù)為3%時到分別達到最大值7.95 g/L和0.410 g/L，分別比對照組提高了6%和10.8%。朱艷等研究表明，在三孢布拉氏霉菌發(fā)酵體系中加入體積分數(shù)為1%的正己烷，番茄紅素的生成量提高了25.32%［10］。

隨著培養(yǎng)基中正己烷的繼續(xù)增加，菌體細胞干重和納他霉素含量不斷減少，當添加體積分數(shù)超過3%時，兩者都低于對照組。上述結(jié)果表明，培養(yǎng)基中較高濃度的正己烷嚴重抑制了褐黃孢鏈霉菌的生長和納他霉素的生物合成。這是因為有機溶劑對細胞生長的影響與其在辛醇-水系統(tǒng)中的分配系數(shù)(LogP)密切相關(guān)，即LogP越高，對細胞的刺激或者毒性越小，生物相容性越好。Laane等曾提出生物相容性較佳的有機溶劑其 LogP應(yīng)該大于4［11］，而正己烷的LogP為3.5，說明較高濃度的正己烷對菌體產(chǎn)生毒害作用。本實驗結(jié)果與這一通用法則是一致的。

納他霉素得率系數(shù)隨著體積分數(shù)升高先升高后下降，3%時達到最大值。這表明正己烷添加濃度較低時對代謝產(chǎn)物的合成作用要大于對細胞生長的影響。添加較高濃度時單位細胞納他霉素含量的也沒有因為生物量的減少而大幅下降。單位細胞的納他霉素含量的變化也充分證明了正己烷作為氧載體是通過控制溶氧量而不是作為碳源提高生物量來提高代謝物產(chǎn)量。

2.2.2 正十二烷添加量的影響

如圖3所示，添加不同濃度的正十二烷對菌體生物量及納他霉素的生物合成都有顯著影響(P＜0.05)。且隨培養(yǎng)基中正十二烷添加濃度的增加，細胞干重和納他霉素的含量都逐漸增加，并在體積分數(shù)為6%的添加濃度時分別達到最大值9.87 g/L和0.495 g/L，分別比對照組提高了22.9%和46.4%。這是因為正十二烷作為氧載體提高溶氧，供細胞生長和代謝需要，使得納他霉素產(chǎn)量提高。歐杰等研究結(jié)果顯示，野油菜黃單胞菌發(fā)酵體系中添加8%的正十二烷，黃原膠的產(chǎn)率提高到4.16%［12］。

當正十二烷的添加體積分數(shù)超過6%時，菌體干質(zhì)量和納他霉素產(chǎn)量總體呈減少的變化趨勢。推測高濃度的正十二烷開始抑制細胞的生長，影響納他霉素發(fā)酵相關(guān)酶的活性，從而降低產(chǎn)量。但菌體干重和納他霉素的產(chǎn)量仍然高于對照組，說明正十二烷對納他霉素的合成起促進作用。

隨著正十二烷的添加濃度的增加，單位細胞納他霉素含量呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢。當正十二烷添加體積分數(shù)為9%時，納他霉素的產(chǎn)率達到最大值53.40 mg/g，比對照組提高了26.9%，比6%時的產(chǎn)率提高了6.5%。這可能是因為許多抗生素的發(fā)酵過程顯示2個階段，即生長階段和生產(chǎn)階段。在生長階段，菌體生長速率高，但產(chǎn)物合成速率底;隨著菌體生長速率的下降，產(chǎn)物大量合成進入生產(chǎn)階段。因此當高濃度的正十二烷開始抑制細胞的生長，發(fā)酵體系的溶氧量仍然適宜納他霉素的合成，雖產(chǎn)量略有下降，但單位細胞納他霉素的產(chǎn)量仍保持著較高的水平［13］。

2.2.3 正十六烷添加量的影響

如圖4所示，正十六烷添加量對細胞干重和納他霉素含量的影響均呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢，在添加體積分數(shù)為6%時分別達到最大值4.20和0.215 g/L，分別比對照組提高19.3%和43.3%，促進效果明顯(P＜0.05)。當正十六烷的添加濃度超過6%，開始抑制褐黃孢鏈霉菌的生長和產(chǎn)物的合成。這可能是因為較高濃度的有機溶劑對細胞產(chǎn)生了明顯抑制作用而干擾納他霉素的合成，或是由于表觀黏度的不斷增加影響了氧傳質(zhì)系數(shù)［11］。

正十六烷添加量對單位細胞納他霉素含量的影響與正十二烷相似。在3%～9%的體積分數(shù)范圍內(nèi)，單位細胞納他霉素的含量增長速度快，這表明納他霉素的合成速度要高于細胞生長速率。這可能是因為氧在正十六烷中的溶解度比在水中的溶解度高8倍，因此正十六烷在發(fā)酵過程中作為氧載體提高氧傳質(zhì)推動力。此外，液態(tài)烷烴在水溶液中形成大量的分散小液滴，增加了相接觸面積，進而提高了培養(yǎng)液中的氧傳質(zhì)系數(shù)［11］。這兩種作用共同促進了發(fā)酵產(chǎn)量的提高。

2.3 氧載體添加時間的影響

2.3.1 正己烷添加時間的影響

在正己烷添加濃度單因素實驗基礎(chǔ)之上，選取添加體積分數(shù)為3.0%正己烷，分別在發(fā)酵后0、24、48和72 h四個時間加入。

由圖5可以看出，由于3%的正己烷對細胞的毒性作用較小，所以在發(fā)酵體系中起到促進作用。在發(fā)酵中的不同時間點添加正己烷，菌體生物量和納他霉素的生物合成量整體上呈現(xiàn)下降趨勢。楊秋艷在黃原膠的研究中發(fā)現(xiàn)，正己烷的最佳加入時間是發(fā)酵后12 h［9］。本實驗中，發(fā)酵初始添加正己烷最利于發(fā)酵產(chǎn)物的合成。發(fā)酵后24 h添加正己烷，納他霉素的產(chǎn)量比發(fā)酵初始值低3.3%。這可能是因為在搖瓶培養(yǎng)時，由于褐黃孢鏈霉菌的耗氧速率很快，接種后數(shù)小時內(nèi)培養(yǎng)液中的溶氧就低于臨界溶氧濃度，成為培養(yǎng)的限制因素。接種同時添加氧載體比指數(shù)生長期添加效果要明顯，就是因為較早加入的氧載體，可以及時緩解培養(yǎng)過程中很快就會出現(xiàn)的氧不足問題［11］。

正己烷添加時間不同對單位細胞納他霉素含量的影響基本上是先略降后略升，最大值是在發(fā)酵初始添加。這是因為正己烷添加時間不同對菌體生長影響比對納他霉素合成的影響小。而后期添加單位質(zhì)量的納他霉素含量升高，可能是因為隨著發(fā)酵的進行，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗細胞生長緩慢，而因此時添加的正己烷提高了體系的溶氧量，延長了發(fā)酵時間，產(chǎn)物仍有合成，所以單位細胞的產(chǎn)物合成量略有上升。

2.3.2 正十二烷添加時間的影響

在正十二烷添加濃度單因素實驗基礎(chǔ)之上，選取添加體積分數(shù)為6.0%的正十二烷分別在發(fā)酵后0、24、48和72 h加入。

圖6可以看出，正十二烷的不同添加時間對菌體生物量和產(chǎn)物合成量有顯著影響(P＜0.05)，細胞干重和納他霉素的含量都呈先增加后減少的變化趨勢。在發(fā)酵后24 h添加體積分數(shù)6%正十二烷分別取得最大值4.980和0.260 g/L，納他霉素產(chǎn)量比發(fā)酵初始添加值高7.0%。

發(fā)酵24 h后再添加正十二烷，細胞干重和納他霉素含量都大幅度下降。推測可能是因為發(fā)酵初期(0～24 h)體系溶氧充足，同時前期生成的產(chǎn)物具有表面活性劑性質(zhì)，可生成大量小氣泡，強化了氣液界面的擴散，提高了氧傳遞速率。此時添加正十二烷使得體系溶氧過高，反而不利于菌體生長和代謝［9］。隨著發(fā)酵的進行，體系中的納他霉素含量不斷增加，黏度增大，同時小氣泡相互接合，氣液比表面積降低，氧傳遞系數(shù)減小，出現(xiàn)溶氧不足問題，此時添加適宜濃度的正十二烷可以增強溶氧量，促進細胞的生長和代謝。

圖6結(jié)果顯示，發(fā)酵24 h后再添加正十二烷，正十二烷對發(fā)酵體系的影響力則大大減弱，這是因為添加時間較晚，沒有及時解決體系的溶氧限制問題，干擾了納他霉素的生物合成，單位細胞納他霉素含量也大量減少。

2.3.3 正十六烷添加時間的影響

在十六烷添加濃度單因素實驗基礎(chǔ)之上，選取添加體積分數(shù)6.0%的正十六烷分別在0、24、48和72 h加入。

圖7可以看出，正十六烷添加時間對發(fā)酵的影響與正己烷的影響作用相同，菌體干質(zhì)量和納他霉素含量都呈下降趨勢，且在發(fā)酵開始添加時分別取得最大值4.863和0.249 g/L。劉元帥等人考察了多種液態(tài)烷烴作為氧載體對法夫酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳條件是在法夫酵母接種同時添加體積分數(shù)10%的正十六烷［11］?？梢钥闯?，正十六烷添加時間對單位細胞納他霉素含量影響作用是先下降后趨于平穩(wěn)。這是因為，添加時間的不同，對細胞生長的影響作用要小于對納他霉素生產(chǎn)的影響。而后，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，生物量降低速率加快，此時加入氧載體增強溶氧一定程度上促進產(chǎn)物合成，最終表現(xiàn)為單位細胞納他霉素含量趨于平穩(wěn)。

3 結(jié)論與討論

本實驗選擇了正己烷、正十二烷和正十六烷作為氧載體，在可利用性實驗的基礎(chǔ)上，考察了氧載體添加濃度和添加時間對納他霉素發(fā)酵體系的影響。結(jié)果表明，氧載體添加種類、濃度和時間不同，對發(fā)酵體系的菌體生長和產(chǎn)物合成影響作用不同。

3.1 結(jié)論

(1)可利用性:液態(tài)烷烴類物質(zhì)在發(fā)酵體系中，沒有作為碳源被利用，而是作為氧載體，提高了發(fā)酵體系的溶氧量，從而促進了代謝產(chǎn)物的合成。

(2)最適添加量:正己烷3%，納他霉素產(chǎn)量比對照組提高了18.8%;正十二烷6%，納他霉素產(chǎn)量比對照組提高了46.4%;正十六烷6%，納他霉素產(chǎn)量比對照組提高了43.3%。

(3)最適添加時間:正己烷發(fā)酵開始時加入;正十二烷發(fā)酵后24 h加入，納他霉素產(chǎn)量比對照組提高了7.0%;正十六烷發(fā)酵開始時加入。

綜合分析，正十二烷和正十六烷的作用效果較好，正十二烷最適添加條件為在發(fā)酵后24 h添加體積分數(shù)為6%(P＜0.05)。

3.2 討論

微生物發(fā)酵是一個復(fù)雜的生化過程，發(fā)酵過程中，氧的傳質(zhì)速率主要受發(fā)酵液中溶解氧的濃度和傳遞阻力影響。微生物只能利用溶解于水中的氧而不能利用氣態(tài)的氧。而氧的溶解實質(zhì)上是氣體吸收過程，是由氣相向液相傳遞的過程。有學(xué)者認為液態(tài)烷烴氧載體具有負鋪展系數(shù)，在水溶液中以油滴形式而非膜的形式存在，并隨著通風(fēng)攪拌作用逐漸集聚在氣液界面上，由于氧進入氧載體的傳質(zhì)速率超過其進入水溶液的傳質(zhì)速率，另一方面，氧從油滴再到水相的傳質(zhì)過程還需克服新的阻力，所以提高供氧能力的綜合效果反映在KL值和a值的變化上［8］。

添加較高濃度的氧載體對細胞的生長產(chǎn)生了抑制作用，這是因為在雙液相發(fā)酵體系中，添加的有機溶劑對細胞產(chǎn)生一定毒性作用。有機溶劑對細胞毒性分為分子毒性和相毒性。而分子毒性指在兩液相培養(yǎng)中，很少量溶解在胞外培養(yǎng)液中的有機溶劑及有機相與細胞的接觸中，導(dǎo)致酶的抑制、蛋白質(zhì)變性和膜的改性，從而影響細胞的正常生長。

在兩液相培養(yǎng)的微生物發(fā)酵中，許多研究者探索了有機溶劑的分子毒性，認為有機溶劑的LogP值能很好地表征有機溶劑對細胞毒性的影響，LogP越大，對細胞的毒性越小，生物相容性更好，但得出有機溶劑對細胞毒性隨有機溶劑的LogP值變化規(guī)律不完全一樣。經(jīng)查閱，正己烷的LogP為3.5，正十六烷的LogP為8.8，且烷烴類物質(zhì)的LogP隨著碳鏈的增加而增加。

為了在發(fā)酵過程中更好的利用氧載體，有以下幾點建議:(1)篩選有機溶劑。選擇對細胞不產(chǎn)生毒性或毒性作用較小的有機溶劑。(2)確定有機溶劑最適添加濃度。有機溶劑加入量減少，可以減少有機溶劑對細胞毒性，但有機溶劑加入量太少又起不到氧載體作用，因此有機溶劑加入量有一個最佳值。(3)確定有機溶劑最適添加時間。提早加入雖然可以避免發(fā)酵過程中溶氧限制問題，但也有有機溶劑對細胞的毒性作用和過高的溶氧對發(fā)酵的反作用。(4)研究有機溶劑選擇規(guī)律。有必要根據(jù)細胞的生理生化特性、有機溶劑特性以及有機溶劑對細胞毒性的機理，對有機溶劑選擇規(guī)律作深入的研究。(5)將新工藝新技術(shù)應(yīng)用于雙液相培養(yǎng)。

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