陳彥文，明海霞，王 強(qiáng)，郭 超，趙 英，高曉蘭

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院解剖教研室,甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院生理教研室，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

大劑量岷縣當(dāng)歸預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠NO、NF-κB的影響*

陳彥文1，明海霞2，王 強(qiáng)1，郭 超1，趙 英1，高曉蘭1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院解剖教研室,甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院生理教研室，甘肅 蘭州 730000)

目的:觀察大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)處理對(duì)缺血-再灌注大鼠心肌組織NO、NOS含量及心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α表達(dá)的影響作用。方法:以不同大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液灌胃6周后，取大鼠心臟進(jìn)行離體灌注，復(fù)制當(dāng)歸缺血預(yù)適應(yīng)模型，以化學(xué)法測(cè)定上清液中NO、NOS含量，SP免疫組化檢測(cè)心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α的表達(dá)。結(jié)果: 與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比，中、高劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)處理組NO、NOS含量均顯著增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比，中、高劑量當(dāng)歸水煎液預(yù)處理組NF-κB在胞漿和胞核中的表達(dá)均有不同程度減少，IκB-α表達(dá)相應(yīng)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論:大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)處理可通過(guò)提高缺血-再灌注大鼠心肌組織NO含量、抑制NF-κB表達(dá)來(lái)保護(hù)缺血-再灌注大鼠的心肌細(xì)胞。

岷縣當(dāng)歸水煎液/藥效學(xué)；缺血-再灌注/藥物作用；細(xì)胞凋亡；NO；NOS；NF-κB；IκB-α；動(dòng)物模型，大鼠

心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemia-reperfusion injury，IR)是心肺復(fù)蘇、心肌梗死溶栓和介入治療，以及心臟移植中的重要病理生理過(guò)程。缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)是心肌保護(hù)的新概念，是迄今為止最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌缺血保護(hù)方法。水煎口服是中醫(yī)臨床常用給藥途徑。我們前期研究表明，大劑量岷當(dāng)歸水煎液預(yù)適應(yīng)可減少或防止大鼠心肌缺血-再灌注室性心律失常的發(fā)生[1]。NF-κB是一種普遍存在的具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的連結(jié)位點(diǎn)位于許多促炎細(xì)胞因子與免疫調(diào)節(jié)因子的啟動(dòng)區(qū)，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等生物反應(yīng)，在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)防性給藥對(duì)缺血-再灌注大鼠心肌組織NO含量和NF-κB表達(dá)的影響作用，進(jìn)一步探討大劑量岷縣當(dāng)歸對(duì)缺血性心肌損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)室提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證為SYXK(甘)2009～0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為SCXK(甘)2009～0006。

1.2 藥品與試劑

岷縣當(dāng)歸藥材，蘭州復(fù)興厚藥材有限公司提供，經(jīng)鑒定符合藥典規(guī)定；岷縣當(dāng)歸水煎液采用常規(guī)煎煮方法制備，濃縮為1g/mL。核因子-κB( NF-κB)試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)990188W；核因子抑制性蛋白(IκB-α)試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)990991W；二抗兔 SP檢測(cè)試劑盒，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)921437A；NO、NOS測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)20110215。

1.3 動(dòng)物分組與模型的建立

麻醉大鼠同時(shí)，腹腔注射肝素，然后隨機(jī)分為6組，每組8只。開(kāi)胸取心臟置于冷灌流液中，主動(dòng)脈逆行插管連接在Langendorff 離體灌流裝置上，以80 mm H2O 的壓力Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液(KH)[(NaCl 118.5，NaHCO325.0，KH2PO41.2，KCl 4.8，MgSO41.2，CaCl222.0，葡萄糖1.0)mmol/L]灌流心臟，用體積分?jǐn)?shù)950 mL/L O2和50 mL /L CO2混合氣體平衡灌流液。

①空白對(duì)照組：以80 mm H2O的壓力KH緩沖液灌流心臟，用體積分?jǐn)?shù)950 mL/L O2和50 mL /L CO2混合氣體平衡灌流液進(jìn)行平衡灌流，不進(jìn)行缺血與缺氧處理。②缺血/再灌注組：大鼠心臟先預(yù)灌注平衡 20 min，然后在無(wú)灌流液、無(wú)氧的條件下，保持心臟溫度恒定在37 ℃，停止灌流40 min(缺血)，之后再?gòu)?fù)灌120 min(再灌)。③缺血預(yù)適應(yīng)組：大鼠心臟先預(yù)灌注平衡 20 min ，再經(jīng)短暫的5 min缺血，10 min再灌注，重復(fù)3次之后，心臟再經(jīng)歷40 min的缺血、120 min的再灌注。④當(dāng)歸小劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組、當(dāng)歸中劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組和當(dāng)歸大劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組：依次給予大鼠當(dāng)歸小(0.54 g/d)、中(1.08 g/d)、大劑量(2.16 g/d)水煎液灌胃，依次相當(dāng)于人劑量的30，60，120 g。給藥6 周后，麻醉動(dòng)物，迅速取心臟連接到離體心臟灌流裝置上，復(fù)制心臟IPC 模型，復(fù)制方法同缺血預(yù)適應(yīng)組。除當(dāng)歸各組外，其余3組于實(shí)驗(yàn)前均以等量生理鹽水灌胃。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 心肌組織NO、NOS含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在同一部位取心肌組織約 200 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測(cè)定前稱(chēng)量質(zhì)量，剪取100 mg左右心肌組織塊，研磨成100 g/L勻漿，低溫離心，取上清液，以化學(xué)法測(cè)定上清液中NO、NOS含量。

1.4.2 心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α表達(dá)

取各組心肌組織制作石蠟組織切片，SP免疫組化染色嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，即于石蠟組織切片上滴加1∶100的抗NF-κBp65抗體(一抗，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)，4 ℃過(guò)夜,以PBS洗滌后，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔的二抗工作液,加DAB顯色后，再以蘇木素襯染，中性樹(shù)膠封片并攝像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌NO、NOS含量對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，缺血/再灌注組NO、NOS含量均顯著下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與缺血/再灌注組相比，缺血預(yù)適應(yīng)組NO、NOS含量均顯著增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比， 中、高劑量岷縣當(dāng)歸預(yù)處理組NO、NOS含量均增高(P<0.05或P<0.01)，且呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，低劑量組則不明顯。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌NO、NOS含量對(duì)比

表1 各組大鼠心肌NO、NOS含量對(duì)比

組 別劑量/(g·d-1)NO/(μmol·g-1)NOS/(IU·mg-1)空白對(duì)照組-7．48±1．670．85±0．20缺血/再灌注組-3．41±0．41?0．32±0．08?缺血預(yù)適應(yīng)組-4．87±0．62#0．48±0．12#當(dāng)歸小劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組0．544．75±0．830．50±0．15當(dāng)歸中劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組1．085．66±1．06△0．60±0．18△當(dāng)歸高劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組2．166．56±1．08△△0．72±0．17△△

注：與空白對(duì)照組對(duì)比： *P<0.05；與缺血/再灌注組對(duì)比，#P<0.05；與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α陽(yáng)性表達(dá)對(duì)比

表達(dá)陽(yáng)性者，在心肌細(xì)胞的胞漿和/或胞核中可見(jiàn)棕黃色或棕黃色顆粒。用圖像分析儀分別測(cè)量每張切片中NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞和IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值作為其相對(duì)的表達(dá)量。缺血/再灌注組NF-κB+于胞漿和胞核中均有明顯表達(dá)， 缺血預(yù)適應(yīng)組NF-κB在胞漿和胞核中的表達(dá)減少，IκB-α表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比，中、高劑量當(dāng)歸預(yù)處理組NF-κB在胞漿和胞核中的表達(dá)均有不同程度減少，IκB-α表達(dá)相應(yīng)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，低劑量組則不明顯。見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值對(duì)比

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞NF-κB、IκB-α陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值對(duì)比

組 別劑量/(g·d-1)NF?κBIκB?α空白對(duì)照組-0．216±0．0500．677±0．120缺血/再灌注組-0．636±0．116?0．302±0．100?缺血預(yù)適應(yīng)組-0．458±0．107#0．447±0．103#當(dāng)歸小劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組0．540．446±0．1040．488±0．108當(dāng)歸中劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組1．080．304±0．100△0．598±0．113△當(dāng)歸高劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組2．160．282±0．098△0．614±0．115△

注：與空白對(duì)照組對(duì)比：*P<0.05；與缺血/再灌注組對(duì)比，#P<0.05；與缺血預(yù)適應(yīng)組對(duì)比，△P<0.05。

圖1 心肌細(xì)胞NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(免疫組化SP法染色，×200)

圖2 心肌細(xì)胞IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(免疫組化SP法染色，×200)

3 討 論

當(dāng)歸有多種心血管藥理作用，臨床可用于缺血性心臟病的治療。中藥湯劑是臨床中藥應(yīng)用的主要形式，劑量是影響中藥湯劑功效方向發(fā)揮的重要因素。在《中國(guó)藥典》中當(dāng)歸湯劑的用量規(guī)定為6～12 g[2]，臨床實(shí)踐表明：當(dāng)歸小劑量應(yīng)用則補(bǔ)血，大劑量應(yīng)用則活血[3]?；钛钱?dāng)歸防治缺血性心肌疾病的主要中藥功效基礎(chǔ)。前期研究[1-2]表明：大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)處理可減少或防止大鼠心肌缺血-再灌注室性心律失常的發(fā)生，可增加心肌組織Bcl-2的表達(dá)而抑制Bax的表達(dá)，從而減少缺血-再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，對(duì)缺血-再灌注大鼠心肌具有明顯保護(hù)作用。

NF-κB是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在靜息情況下，以同源二聚體形式存在于胞質(zhì)中，并與抑制性蛋白IκB結(jié)合呈無(wú)活性狀態(tài)。離體工作心臟模型可以觀察到，心臟單純性短暫缺血即可引起NF-κB活性顯著升高，短暫再灌注即可進(jìn)一步升高NF-κB活性，說(shuō)明IR可激活NF-κB 。NF-κB是心臟應(yīng)激反應(yīng)快速表達(dá)基因，可引起某些細(xì)胞因子、黏附分子的過(guò)度表達(dá)，從而在IR過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。有研究證實(shí)：抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄，可減少I(mǎi)L-1和TNF-α等促炎癥因子的表達(dá)，從而表現(xiàn)出明顯的抗炎活性[5]。因此，通過(guò)抑制NF-κB的活化或者降低NF-κB的活性，可以下調(diào)促炎因子的表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，促進(jìn)IR后心功能的恢復(fù)[6]。

NO是一種很強(qiáng)的舒血管物質(zhì)，可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善微循環(huán)；抑制中性粒細(xì)胞趨化、聚集與黏附，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要保護(hù)作用。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的NO對(duì)調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈基礎(chǔ)張力和心肌血流灌注有重要作用。內(nèi)源性NO生成減少，可激活NF-κB活性[7]，說(shuō)明內(nèi)源性NO的抗炎活性、心肌保護(hù)作用與NF-κB有一定的相關(guān)性。

本研究結(jié)果證實(shí)：以大劑量岷縣當(dāng)歸水煎液預(yù)處理，可明顯增加缺血再灌注大鼠NO含量，上調(diào)IκB表達(dá)，從而抑制NF-κB的活化或降低NF-κB的活性，尤其以相當(dāng)于人劑量的120g的大劑量當(dāng)歸水煎液較為顯著。此表明：大劑量岷縣當(dāng)歸可能通過(guò)藥物調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)生成而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0053-04

R541.6

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.27

陳彥文(1969-)，男(漢族)，甘肅隴南人，學(xué)士，副教授，主要研究方向?yàn)橹形鹘Y(jié)合防治心腦血管疾病基礎(chǔ)研究。

明海霞，副教授， 18909429885@163.com

甘肅省教育廳基金項(xiàng)目(044B-03)

2014-10-22；

2015-03-17