謝俏，董麗鳳，徐有青，崔培林

(1北京市垂楊柳醫(yī)院，北京100022;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

胰腺惡性腫瘤對(duì)化療及放療的反應(yīng)性差，因此 預(yù)后較差，為惡性程度較高的腫瘤之一。褪黑素是由松果體分泌的一種多功能的吲哚胺，近年多項(xiàng)研究證實(shí)其具有抑癌作用。Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路不僅可以決定細(xì)胞分化，而且在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。2010年11月～2011年7月，我們觀察了褪黑素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞(PANC-1細(xì)胞)增殖的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 褪黑素、細(xì)胞及試劑 褪黑素;PANC-1細(xì)胞;高糖DMEM培養(yǎng)基，噻唑藍(lán)(MTT)，95%乙醇，胎牛血清，γ內(nèi)分泌酶抑制劑(DAPT)，DMSO，兔抗人NICD1，抗 β-actin 抗體，鼠抗兔 IgG，TRIzol，發(fā)光液。

1.2 PANC-1細(xì)胞分組及褪黑素干預(yù) 取PANC-1細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為以下幾組:①對(duì)照1組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。②褪黑素處理組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，將PANC-1細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中分別加入濃度為1 000 000、1 000、1 nmol/L的褪黑素(用95%的乙醇稀釋褪黑素)，培養(yǎng)24 h。取以上2組處理細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖率和Notch活性片段NICD1表達(dá)的檢測(cè)。③對(duì)照2組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。④DAPT組:選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，在 PANC-1細(xì)胞完全培養(yǎng)基中加10 μmol/L DAPT，培養(yǎng)24 h。

1.3 PANC-1細(xì)胞增殖率計(jì)算 取約3×104個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后取于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞分成對(duì)照1組、褪黑素組和對(duì)照2組、DAPT組，按照分組情況在培養(yǎng)基中加褪黑素、DAPT培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加MTT(5.0 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入 DMSO 150 μL，避光振蕩15 min，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度值(A值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率，即細(xì)胞增殖率=A對(duì)照組/A實(shí)驗(yàn)組×100%。

1.4 PANC-1細(xì)胞NICD1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。將細(xì)胞分成對(duì)照1組、褪黑素組和對(duì)照2組、DAPT組，按分組情況處理后取約2.6×107個(gè)細(xì)胞，懸于細(xì)胞裂解液中冰浴30 min，裂解細(xì)胞，以12 000 r/min離心15 min，提取蛋白質(zhì)，定量后取90 μg蛋白與5×加樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，冷卻后上樣。恒壓電泳2 h，4℃下將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST洗滌3次，5 min/次。加入兔抗人NICD1(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，5 min/次。加入抗兔二抗(1∶3 000)，室溫振蕩孵育2 h，TBST 洗滌3 次，5 min/次。加入化學(xué)發(fā)光液，暗室中顯影2 min，TBST洗滌，晾干。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照1組細(xì)胞增殖率為0.38% ±0.03%，褪黑素組加入1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后細(xì)胞增殖率分別為 0.36% ± 0.02%、0.32% ±0.02%、0.26% ±0.01%，對(duì)照1 組與褪黑素組加入1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后增殖率比較，P均 ＜0.05。對(duì)照 2組細(xì)胞增殖率為 0.43% ±0.02%，DAPT 組細(xì)胞增殖率為 0.30% ±0.02%，兩組比較，P＜0.05。對(duì)照1組NICD1相對(duì)表達(dá)量為0.47 ± 0.05，褪黑素組加入 1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.04、0.33 ±0.05、0.21 ±0.03，對(duì)照 1 組與褪黑素組加入1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相對(duì)表達(dá)量比較，P均＜0.05。對(duì)照2組NICD1相對(duì)表達(dá)量為0.63±0.05，DAPT組 NICD1相對(duì)表達(dá)量為0.38 ±0.03，兩組比較，P ＜0.05。

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度高、診斷和治療困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌，其發(fā)病率和病死率高。胰腺癌5年生存率不足1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。PANC-1細(xì)胞是從人胰腺癌中分離出來(lái)的腫瘤細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中用PANC-1細(xì)胞模擬胰腺癌的體外模型。

褪黑素是人體內(nèi)重要的抗腫瘤天然屏障，很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與褪黑素相關(guān)。大量研究表明，褪黑素的抗腫瘤活性可能與其免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、抗氧化和抗血管新生機(jī)制相關(guān)。目前已有研究［1，2］表明，褪黑素的生物學(xué)機(jī)制可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，但是沒有直接數(shù)據(jù)表明褪黑素對(duì)胰腺癌細(xì)胞有增殖抑制作用。我們前期的研究表明，褪黑素可以抑制不同腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤化療方案的發(fā)展。研究［3］證實(shí)，Notch信號(hào)通路參與胰腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由此我們假設(shè)褪黑素與Notch信號(hào)通路的相關(guān)性。

高濃度的褪黑素可以抑制PANC-1細(xì)胞的增殖，但低濃度(幾乎為生理濃度)的褪黑素不能明顯抑制細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，褪黑素對(duì)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抗增殖作用可能有兩種機(jī)制，一種是阻斷細(xì)胞循環(huán)，另外一種是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。褪黑素(生理水平的10倍以上)可以阻斷PANC-1細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的S期，因此減少細(xì)胞數(shù)，抑制細(xì)胞增殖。褪黑素從以下三個(gè)方面參與細(xì)胞凋亡過(guò)程:①褪黑素抑制免疫細(xì)胞的凋亡;②褪黑素阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡;③褪黑素增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率。這些研究結(jié)果均提示褪黑素的作用可能與細(xì)胞的類型、不同功能狀態(tài)下的細(xì)胞或其他因素如藥物濃度有關(guān)［5，6］。本實(shí)驗(yàn)表明，褪黑素的作用劑量為關(guān)鍵因素，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，提示褪黑素的作用劑量和作用時(shí)間對(duì)其效應(yīng)有決定性意義。同樣作用24 h，高濃度的褪黑素可以導(dǎo)致PANC-1細(xì)胞凋亡增加，但是接近生理濃度(1 nmol/L)的褪黑素卻不能有上述作用。

Notch信號(hào)通路在胰腺癌細(xì)胞的增殖以及凋亡中起重要作用［7］。γ內(nèi)分泌酶切割跨膜蛋白從而激活Notch信號(hào)通路，釋放的細(xì)胞內(nèi)部分向細(xì)胞核遷移，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而導(dǎo)致許多基因的表達(dá)［8］。DAPT可以抑制Notch信號(hào)通路的激活，還可以抑制細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致癌癥細(xì)胞的凋亡。用siRNA下調(diào)Notch1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致體外胰腺癌細(xì)胞凋亡［9，10］。本實(shí)驗(yàn)中用 DAPT處理PANC-1細(xì)胞后，增殖率明顯下降。由此我們推斷，抑制Notch信號(hào)通路可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，即Notch通路可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。高濃度褪黑素可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，Notch通路的抑制劑DAPT同樣可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。我們猜測(cè)高濃度的褪黑素可以通過(guò)Notch信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞的增殖。

我們?cè)赑ANC-1細(xì)胞中檢測(cè)到NICD1的表達(dá)，這表明Notch信號(hào)通路在胰腺癌細(xì)胞中是處于持續(xù)激活狀態(tài)的。這與近年來(lái)的研究提示Notch信號(hào)通路在胰腺癌中高表達(dá)一致［11～15］。在 PANC-1細(xì)胞中檢測(cè)到Notch1的活性片段也證實(shí)了Notch信號(hào)通路作為促癌基因在胰腺癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)選取不同濃度的褪黑素對(duì)胰腺癌細(xì)胞作用24 h后，檢測(cè)NICD1的表達(dá)情況提示，生理濃度(低濃度)的褪黑素可以抑制NICD1的表達(dá)，這可以解釋正常生理?xiàng)l件下不會(huì)患胰腺癌。由此推測(cè)胰腺癌的發(fā)生在某種程度上可能與褪黑素濃度下降相關(guān)。褪黑素生理節(jié)奏紊亂即分泌高峰延遲，可能會(huì)導(dǎo)致包括胰腺癌在內(nèi)的上消化道系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生［16］。高濃度的褪黑素可以顯著下調(diào)NICD1的表達(dá)，高濃度的褪黑素同樣可以顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖，由此我們推斷，褪黑素通過(guò)抑制Notch通路進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

［1］Lissoni P.The pineal gland as a central regulator of cytokine network［J］.Neuro Endocrinol Lett，1999，20(6):343-349.

［2］Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metastasis:correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med，1991，324(1):1-8.

［3］Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(3):483-493.

［4］Cui P，Luo Z，Zhang H，et al.Effect and mechanism of melatonin's action on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells［J］.J Pineal Res，2006，41(4):358-362.

［5］Sainz RM，Mayo JC，Rodriguez C，et al.Melatonin and cell death:differential actions on apoptosis in normal and cancer cells［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60(7):1407-1426.

［6］Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ.Notch signaling:cell fate control and signal integration in development［J］.Science，1999，284(5415):770-776.

［7］Miele L.Notch signaling［J］.Clin Cancer Res，2006，12(4):1074-1079.

［8］Wong H，Lemoine NR.Pancreatic cancer:molecular pathogenesis and new therapeutic targets［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2009，6(7):412-422.

［9］Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(3):483-493.

［10］Wang Z，Zhang Y，Banerjee S，et al.Notch-1 down-regulation by curcumin is associated with the inhibition of cell growth and the induction of apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Cancer，2006，106(11):2503-2513.

［11］Pawlikowski M，Winczyk K，Karasek M.Oncostatic action of melatonin:facts and question marks［J］.Neuro Endocrinol Lett，2002，23(Suppl 1):24-29.

［12］Mumm JS，Kopan R.Notch signaling:from the outside in［J］.Dev Biol，2000，228(2):151-165.

［13］Miyamoto Y，Maitra A，Ghosh B，et al.Notch mediates TGF alpha induced changes in epithelial differentiation during pancreatic tumorigenesis［J］.Cancer Cell，2003，3(6):565-576.

［14］Apelqvist A，Li H，Sommer L，et al.Notch signalling controls pancreatic cell differentiation［J］.Nature，1999，400(6747):877-881.

［15］Büchler P，Gazdhar A，Schubert M，et al.The Notch signaling pathway is related to neurovascular progression of pancreatic cancer［J］.Ann Surg，2005，242(6):791-801.

［16］Muc-Wierzgon M，Nowakowska-Zajdel E，Zubelewicz M，et al.Circadian fluctuations of melatonin，tumor necrosis factor-alpha and its soluble receptors in circulation of patients with advanced gastrointestinal cancer［J］.J Exp Clin Cancer Res，2003，22(2):171-178.