馬文超，劉同祥，徐雁，王小龍，李維政，謝地誠

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫(yī)院)

心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織PGC-1α的表達(dá)變化及意義

馬文超1，劉同祥2，徐雁1，王小龍1，李維政1，謝地誠1

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織過氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)輔助激活因子1α(PGC-1α)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 將21只Wistar大鼠隨機分為缺血/再灌注模型組(I/R組)、GW9662組、假手術(shù)組，各7例。I/R組采用在體結(jié)扎左前降支方法建立缺血/再灌注大鼠模型，結(jié)扎左前降支使其缺血30 min，再灌注120 min；GW9662組建立模型1 d前靜脈注射GW9662，劑量0.3 mg/kg；假手術(shù)組開胸繞過左前降支不做冠狀動脈結(jié)扎，剩余步驟同I/R組。RT-PCR法檢測各組大鼠心肌組織PGC-1α mRNA，Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織PGC-1α蛋白，ELLSA法測定各組大鼠血清中肌鈣蛋白I。結(jié)果 I/R組、GW9662組、假手術(shù)組PGC-1α mRNA分別為1.70±0.09、1.00±0.07、0.86±0.03，PGC-1α蛋白分別為2.80±0.21、1.00±0.15、0.65±0.05，I/R組、GW9662組與假手術(shù)組比較，I/R組與GW9662組比較，P均<0.05。I/R組、GW9662組PGC-1α mRNA及蛋白表達(dá)與其血清中cTnI水平呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織中PGC-1α表達(dá)上調(diào)，與血清中cTnI水平呈負(fù)相關(guān)，具有心臟保護作用。

關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增值激活受體γ輔助活化因子1α；缺血/再灌注損傷；肌鈣蛋白I

心肌缺血/再灌注損傷是臨床心肌梗死患者PCI術(shù)后冠狀動脈再通中常見的生理、病理現(xiàn)象，目前認(rèn)為心肌能量代謝障礙是缺血/再灌注損傷的始發(fā)環(huán)節(jié)[1]。線粒體是提供細(xì)胞能量最重要的細(xì)胞器，因此通過對線粒體能量代謝的靶向治療成為了當(dāng)前研究預(yù)防、治療心肌缺血/再灌注損傷的熱點。過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)輔助活化因子1α(PGC-1α)是一種核輔激活因子，屬于PPARγ家族的一員。研究[2]發(fā)現(xiàn)，PGC-1α在調(diào)節(jié)生理和病理條件下的心肌能量代謝中起重要作用，是線粒體的主要調(diào)控因子。本實驗觀察了心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌中PGC-1α的表達(dá)變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1主要藥品和試劑TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒、肌鈣蛋白(cTn)I檢測試劑盒購自上海勁馬實驗設(shè)備有限公司；DNA Marker DL1000購自晶美公司；成年雄性Wistar大鼠21只，鼠齡8周，體質(zhì)量(260±40)g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2缺血/再灌注動物模型建立和分組將21只大鼠隨機分為3組。①缺血/再灌注組(I/R組)：將大鼠以10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，仰臥位固定，將銀針電極插入四肢皮下，連接MS4000U生物信號定量記錄系統(tǒng)。分離氣管并插管后立即行正壓人工呼吸(呼吸頻率70次/min，潮氣量20 mL/kg，呼吸比1∶1)。從左側(cè)3、4肋間打開胸腔，暴露心臟，剪破心包膜，在肺動脈圓錐左緣與左心耳右緣之間、平左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度1～2 mm、寬度2～3 mm，用5/0無損傷縫合線穿過心肌層，繞過冠狀動脈左前降支結(jié)扎。心電圖顯示ST-T抬高、T波高聳，提示結(jié)扎成功。30 min后解除結(jié)扎，使冠脈再灌注120 min，再灌注時局部組織充血。以心肌顏色恢復(fù)，心電圖ST段下降50%以上提示再灌注的成功。再灌注結(jié)束后迅速剪下心臟，在心室前壁相同位置留取心肌組織液氮冷凍，分別提取蛋白及組織RNA。②GW9662組：建立模型1 d前靜脈注射PPARγ特異性阻斷劑GW9662，劑量0.3 mg/kg，剩余步驟同I/R組。③假手術(shù)組：開胸繞過左前降支不做冠狀動脈結(jié)扎，剩余步驟同I/R組。

1.3各組大鼠心肌組織PCR-1α mRNA檢測采用TRIzol提取大鼠心肌組織中總RNA，紫外線分光光度儀測定RNA濃度，并采用Promega試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，后以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，各樣品同時擴增。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)掃描分析擴增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴增帶吸光度值，將目的基因的擴增條帶與內(nèi)參照β-actin擴增條帶吸光度比值作為其mRNA相對表達(dá)量。

1.4各組大鼠心肌組織PGC-1α蛋白檢測采用Western blotting法。組織勻漿，BCA法蛋白定量，蛋白制樣，配制SDS-PAGE凝膠，上樣量40 μg/lane，采用電泳系統(tǒng)80 V 45 min進(jìn)行濃縮，120 V 80 min進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜，封閉，加PGC-1α一抗，稀釋濃度1∶1 000，加二抗雜交，化學(xué)發(fā)光顯色，以相對比值進(jìn)行相對定量。

1.5各組大鼠血清cTnI檢測實驗結(jié)束時(再灌注末)，經(jīng)腹主動脈快速抽取動脈血3~4 mL，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，置-70 ℃冰箱中保存，按照ELLSA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測cTnI。

2結(jié)果

各組大鼠PGC-1α mRNA及蛋白水平比較見表1。I/R組、GW9662組、假手術(shù)組cTnI分別為(0.28±0.01)、(0.32±0.02)、(0.06±0.02)μg/L，I/R組、GW9662組與假手術(shù)組比較，P均<0.01；GW9662組與I/R組比較，P<0.05。I/R組PGC-1α mRNA表達(dá)與其血清中cTnI含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.92，P=0.003)；GW9662組PGC-1α mRNA表達(dá)與其血清中cTnI含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.21，P=0.031)；假手術(shù)組PGC-1α mRNA表達(dá)與其血清中cTnI含量無相關(guān)性(r=0.41，P=0.357)。I/R組PGC-1α蛋白表達(dá)與其血清中cTnI含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.98，P=0.000)；GW9662組PGC-1α蛋白表達(dá)與其血清中cTnI含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.93，P=0.003)；假手術(shù)組PGC-1α蛋白表達(dá)與其血清中cTnI含量無相關(guān)性(r=0.62，P=0.142)。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與I/R組比較，△P<0.05。

3討論

目前認(rèn)為，心肌缺血/再灌注損傷過程中伴隨著能量代謝一系列異常的變化，心肌缺血實施再灌注在挽救存活細(xì)胞的同時也損傷細(xì)胞。心肌缺血/再灌注能夠引起線粒體代謝異常導(dǎo)致心肌能量障礙，發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死，線粒體作為缺血/再灌注損傷靶點的重要性目前已經(jīng)得到了共識[3]。線粒體在缺血、缺氧狀況下，由于心肌ATP生成減少，Ca2+大量涌入，出現(xiàn)功能障礙、受損及數(shù)量減少，為氧自由基損傷、Ca2+超載、再灌注心律失常的發(fā)生創(chuàng)造了基礎(chǔ)條件，成為心肌損傷的始發(fā)環(huán)節(jié)[2]。而作為線粒體的生物主導(dǎo)協(xié)調(diào)因子——PGC-1α在線粒體功能及增長中發(fā)揮著重要作用，是心臟能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，可直接對生物刺激調(diào)控線粒體的合成和表達(dá)做出相應(yīng)反應(yīng)[4～7]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，心肌缺血/再灌注損傷后PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)也隨之上調(diào)。說明當(dāng)心肌急性缺血損傷后，通過PPARγ等途徑，使心肌細(xì)胞中PGC-1α mRNA的表達(dá)上調(diào)，活化PGC-1α蛋白的能力上調(diào)，并進(jìn)一步激活下游核呼吸分子(NRFs)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Tfam)[8,9]、活化雌激素等相關(guān)受體等轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)線粒體的合成代謝、葡萄糖的利用以及脂肪酸氧化等一系列生理過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌能量代謝。PGC-1α過表達(dá)還可以使ATP/ADP跨膜轉(zhuǎn)運增加，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[6]。

cTn是心肌收縮調(diào)節(jié)蛋白，存在于肌凝蛋白和肌纖蛋白表面，含cTnT、cTnI、cTnC這3個亞單位，共同調(diào)節(jié)心肌收縮，其中cTnI是心肌特有的。當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時，cTnI能夠快速釋放入血，在血清中濃度升高，其升高程度與心肌損傷程度成正比。cTnI是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，常被稱為是鑒別心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。本實驗通過測定3組大鼠血清中cTnI水平來評價心肌損傷程度。結(jié)果顯示，I/R組、GW9662組PGC-1α表達(dá)均上調(diào)，且均與血清cTnI水平呈負(fù)相關(guān)，提示PGC-1α能夠抑制心肌缺血/再灌注損傷，阻止cTnI外流至血液中，進(jìn)一步證實了PGC-1α具有保護心臟作用，但其作用機制仍需進(jìn)一步研究。

已有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑吡格列酮能夠通過激動PPARγ上調(diào)PGC-1α，并有抗心肌凋亡作用，這為預(yù)防及治療糖尿病患者PCI術(shù)后心肌缺血/再灌注損傷提供了新的思路[11]。根據(jù)本實驗推測，心肌急性缺血/再灌注損傷過程中會激動上調(diào)PGC-1α表達(dá)，通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)能量代謝，促進(jìn)線粒體的合成生長，從而改善心肌能量障礙，起到保護心臟的作用。

綜上所述，心肌缺血/再灌注損傷過程中PGC-1α表達(dá)上調(diào)，PGC-1α表達(dá)與血清中cTnI水平成負(fù)相關(guān)，具有保護心臟作用，但PGC-1α隨著缺血時間延長能否持續(xù)上調(diào)表達(dá)，有待完善實驗及分組做進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] De Luca G, Iorio S, Venegoni L, et al. Evaluation of intracoronary adenosine to prevent periprocedural myonecrosis in elective percutaneous coronaryintervention (from the PREVENT-ICARUS Trial)[J]. Am J Cardiol, 2012,109(2):202-207.

[2] Rowe GC, Jiang A, Arany Z. PGC-1 coactivators in cardiac delelopment and disease[J]. Circ Res, 2010,107(7):825-838.

[3] Chen Q, Camara AK, Stowe DF, et al. Modulation of electrontransport protects cardiac mitochondria and decreases myocardial injury ischemia and reperfusion[J]. AM J Physiol Cell Physiol, 2007,291(1):137-147.

[4] 張平,郭瑩,張宇,等.PGC-1α與心臟生理和疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2012,52(28)：92-93.

[5] Brown DA, O′Rourke B. Cardiac mitochondria and arrhythmias[J]. Cardiouasc Res, 2010,88(2):2041-2049.

[6] Won JC, Park JY, Kim YM, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1-alpha overexpression prevents endothelial apoptosis by increasing ATP/ADP translocase activity[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010,30(2):290-297.

[7] Schiling J, Kelly DP. The PGC-1 cascade as a therapeutic target for heart failure[J]. J Mol Cell Cardiol, 2010,51(4):578-583.

[8] Kelly DP, Scarpulla RC. Transcriptional regulatory circuits controlling mitochondrial biogenesis and function[J]. Genes Dev, 2004,18(4):357-368.

[9] Puigserver P, Spiegelman BM. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha (PGC-1 alpha):transcriptional coactivator and metabolic regulator[J]. Endocr Rev, 2003,24(1):78-90.

[10] Chon H, Lee S, Yoon SY, et al. SERS-based competitive immunoassay of troponin I and CK-MB markers for early diagnosis of acute myocardial infarction[J]. Chem Commun (camb), 2014,50(9):1058-1060.

[11] 申琳,王浩,葉平,等.吡格列酮對大鼠缺血再灌注心肌過氧化物酶體增值激活受體γ輔助因子1α表達(dá)影響[J].南方醫(yī)科醫(yī)學(xué)學(xué)報,2014,34(2):197-200.

(收稿日期：2014-11-26)

通信作者：劉同祥

中圖分類號：R318

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.010