熊永福，閆再華，楊召，李敬東(川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637007；川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

穩(wěn)定高表達(dá)CYP2E1基因肝癌HepG2細(xì)胞系的構(gòu)建

熊永福1，閆再華1，楊召1，李敬東2(1川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637007；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的 構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)CYP2E1基因的肝癌HepG2細(xì)胞系。方法通過(guò)NCBI查詢(xún)CYP2E1的編碼序列，設(shè)計(jì)并構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1，用載體對(duì)應(yīng)的慢病毒包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。利用攜帶CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)感染HepG2細(xì)胞系，采用嘌呤霉素抗性篩選方法構(gòu)建高表達(dá)CYP2E1肝癌HepG2細(xì)胞系。增強(qiáng)綠色熒光蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，熒光定量PCR及Western blotting檢測(cè)HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白。結(jié)果HepG2細(xì)胞系均成功轉(zhuǎn)染CYP2E1基因。HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系中CYP2E1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08，轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系與前兩者比較，P均<0.05。結(jié)論通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)CYP2E1基因的肝癌HepG2細(xì)胞系。

關(guān)鍵詞：CYP2E1基因；慢病毒載體；肝癌；HepG2細(xì)胞

原發(fā)性肝癌是臨床常見(jiàn)的高致命性癌癥。美國(guó)癌癥中心數(shù)據(jù)顯示2014年全美新增肝膽癌患者33 190例，占所有新增腫瘤患者的2.0%。近10年肝癌發(fā)病率以每年4.2%的速度遞增。雖然影像檢查與外科技術(shù)的迅猛發(fā)展使得大部分肝癌患者可以接受手術(shù)治療，也使其5年生存率由3.0%提高到了16.8%[1]。但由于該病起病隱匿、進(jìn)展迅速、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，病死率依然高居惡性腫瘤第2位[2]。因此，研究肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找關(guān)鍵信號(hào)通路作為治療靶點(diǎn)，從而提出新的防治措施是當(dāng)務(wù)之急。細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)是肝臟的重要代謝酶，參與肝病和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，并可通過(guò)增加花生四烯酸(AA)等環(huán)節(jié)參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[3]。對(duì)CYP2E1的研究有助于尋找治療肝癌的新靶點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)慢病毒載體在HepG2細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)CYP2E1基因的持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，為深入研究CYP2E1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑、質(zhì)粒和細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞系、慢病毒載體pLVX及包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G由阿爾伯特·愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院宗海紅教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α細(xì)胞由川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所惠贈(zèng)；人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系由川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所保存；用于慢病毒包裝的293T細(xì)胞株購(gòu)自ATCC公司(USA)；TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(USA)；質(zhì)粒小量提取和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；ImProm-ⅡTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司(USA)；胎牛血清及各種培養(yǎng)液分別購(gòu)自Hyclone公司和Sigma公司(USA)；CYP2E1抗體(Anti-Cytochrome P450 2E1 antibody)購(gòu)自英國(guó)ABCAM公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系、L02細(xì)胞系培養(yǎng)于加入10%小牛血清(Gibco，USA)的DMEM(Hyclone，USA)培養(yǎng)基中。細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)[4]。

1.3CYP2E1基因慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系查詢(xún)CYP2E1的編碼序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過(guò)NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)檢測(cè)序列的特異性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。以L02中所獲得的cDNA為模板，利用PlatinumRTaq高保真DNA聚合酶(Invitrogen，USA)通過(guò)PCR擴(kuò)增得到帶有XmaⅠ酶切位點(diǎn)的CYP2E1編碼序列，將CYP2E1序列連接入pLVX[pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1]的相應(yīng)位點(diǎn)之間得到重組質(zhì)粒pLVX，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選并經(jīng)測(cè)序(Invitrogen公司)證實(shí)。擴(kuò)增并收集測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pLVX載體，用pLVX載體對(duì)應(yīng)的慢病毒包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。將加入上述質(zhì)粒共培養(yǎng)的293T細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。48 h后吸取培養(yǎng)基并用0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集病毒上清。使用Lenti-X GoStix試劑盒測(cè)定病毒滴度。編號(hào)后將病毒上清保存于-80 ℃冰箱。將沒(méi)有插入CYP2E1基因片段的載體作為空載對(duì)照。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2，消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按1×105/瓶的HepG2細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)12 h，待細(xì)胞全部貼壁，鋪板到50%左右。預(yù)先37 ℃水浴解凍攜帶CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)病毒上清，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基對(duì)半稀釋?zhuān)尤肴肃堰拭顾刂两K濃度為6 μg/mL。吸出原瓶中培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入上述含病毒培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后換正常的DMEM完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，同時(shí)將嘌呤霉素濃度調(diào)整至4 μg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，2 d換液1次，篩選6 d。將沒(méi)有插入CYP2E1基因片段的HepG2細(xì)胞系作為空載對(duì)照細(xì)胞。

1.4穩(wěn)定高表達(dá)CYP2E1基因HepG2細(xì)胞系的鑒定

1.4.1CYP2E1檢測(cè)采用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)測(cè)定。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡檢測(cè)重組質(zhì)粒pLVX中的綠色熒光蛋白eGFP表達(dá)情況，以證實(shí)eGFP-Puro-CYP2E1成功整合到HepG2細(xì)胞系基因組中，并表達(dá)eGFP蛋白。于轉(zhuǎn)染后2、4、6 d分別檢測(cè)熒光蛋白表達(dá)情況。經(jīng)傳代培養(yǎng)后凍存，3個(gè)月后復(fù)蘇并于復(fù)蘇后2、4、6 d觀察熒光情況。

1.4.2CYP2E1 mRNA檢測(cè)采用熒光定量PCR檢測(cè)。分別接種HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系至6孔板(約1×105個(gè))，培養(yǎng)細(xì)胞約24 h，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，用RNeasy Mini Kit提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop2000測(cè)定濃度及純度。用PrimeSeript RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取上述3種細(xì)胞的cDNA各1 μL為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)CYP2E1 mRNA的表達(dá)。

1.4.3CYP2E1蛋白檢測(cè)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度90%左右的正常HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系。吸棄培養(yǎng)基，冷PBS漂洗3遍，吸盡培養(yǎng)瓶(25 cm2)殘液后加入200 μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育3 min后用細(xì)胞刮迅速刮下，吸入500 μL EP管中，然后將EP管置于冰上繼續(xù)裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后加入5×SDS-PACE上樣緩沖液，100 ℃變性5 min。每組樣品取總蛋白60 μg，10%SDS-PACE電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜(約12 h)，第2天用TBST洗膜3次(每次10 min)，再加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(每次10 min)后，加入Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑后用GE冷CCD成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)三者CYP2E1蛋白表達(dá)水平。

2結(jié)果

eGFP-Puro-CYP2E1成功轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞系，并表達(dá)熒光蛋白。復(fù)蘇后2、4、6 d所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度有所減弱，但表達(dá)率仍接近100%。詳見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖5。HepG2、空載及轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系中CYP2E1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08，轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系與前兩者比較，P均<0.05。

3討論

基因過(guò)表達(dá)技術(shù)是通過(guò)不同途徑將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，使其表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因(或蛋白質(zhì))功能的研究[5]?；?qū)氲幕痉椒ㄖ饕谢瘜W(xué)法、物理法和生物法。然而理化方法簡(jiǎn)單粗暴、轉(zhuǎn)染效率低，對(duì)細(xì)胞損傷明顯，且不能實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，局限了其應(yīng)用范圍[6]。而以慢病毒轉(zhuǎn)染為代表的生物法，既可以提供高效的基因轉(zhuǎn)染又可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)。尤其是以Ⅰ型人類(lèi)免疫缺損病毒(HIV-1)為代表的慢病毒[7,8]。但該方法步驟繁瑣復(fù)雜，技術(shù)難度較大，具有潛在生物危害。本研究為構(gòu)建持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)CYP2E1基因的HepG2細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)真正的目的基因與自身遺傳物質(zhì)整合，減少外源基因?qū)Ψ腔蛳嚓P(guān)特性的影響，最大限度保留HepG2自身生物學(xué)特性，采用了HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)，這也是目前較為理想的基因轉(zhuǎn)染載體[9,10]。

細(xì)胞色素P450為肝臟主要代謝酶，該酶系有100多種同工酶，CYP2E1約占其總量的7%。雖然CYP2E1不是藥物的主要代謝酶，但參與環(huán)境致癌物代謝，在多種癌癥易感性中起重要作用[11]。Caro等[12]研究證實(shí)：CYP2E1通過(guò)Ca2+-磷脂酶A2(PLA2)的激活加劇AA的產(chǎn)生并直接參與AA代謝，而AA在環(huán)氧合酶2(COX-2)的作用下轉(zhuǎn)化前列腺素E2，后者導(dǎo)致EGFR/Met信號(hào)激活引起肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。CYP2E1作為代謝酶不僅通過(guò)其代謝過(guò)程中的各種底物與產(chǎn)物參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，我們課題組的研究[13]還表明CYP2E1本身就能夠促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。枯否細(xì)胞(KCs)約占肝臟細(xì)胞的15%，是最重要的肝癌相關(guān)巨噬細(xì)胞。我們的研究證實(shí)CYP2E1可以直接通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)KCs基因表達(dá)和功能轉(zhuǎn)化。而KCs的功能轉(zhuǎn)化在肝癌的細(xì)胞維持、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過(guò)程中扮演了極其重要的作用?？梢?jiàn)，CYP2E1有望成為防治肝癌的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(1):9-29.

[2] Kudo M, Matsui O, Izumi N, et al. Transarterial chemoembolization failure/refractoriness: JSH-LCSGJ criteria 2014 update[J]. Oncology, 2014,(87 Suppl 1):22-31.

[3] 許鐘,謝斌,吳小翎.CYP2E1在肝細(xì)胞癌中的作用研究進(jìn)展[J].國(guó)際消化病雜志,2009,(4):271-272,282.

[4] 曾云,楊穎,張建武,等.腺病毒介導(dǎo)的LacZ基因在人肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá)[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(2):124-126.

[5] Zhang Y, Wang Y, Wang C. Gene overexpression and gene silencing in Birch using an Agrobacterium-mediated transient expression system[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(5):5537-5541.

[6] Gilbert JL, Purcell J, Strappe P, et al. Comparative evaluation of viral, nonviral and physical methods of gene delivery to normal and transformed lungepithelial cells[J]. Anticancer Drugs, 2008,19(8):783-788.

[7] Lathuilière A, Bohrmann B, Kopetzki E, et al. Genetic engineering of cell lines using lentiviral vectors to achieve antibody secretion following encapsulated implantation[J]. Biomaterials, 2014,35(2):792-802.

[8] Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, et al. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo[J]. Nat Biotechnol, 1997,15(9):871-875.

[9] Follenzi A, Sabatino G, Lombardo A, et al. Efficient gene delivery and targeted expression to hepatocytes in vivo by improved lentiviral vectors[J]. Hum Gene Ther, 2002,13(2):243-260.

[10] Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors[J]. Mol Biotechnol, 2007,36(3):184-204.

[11] Leung TM, Nieto N. CYP2E1 and oxidant stress in alcoholic and non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2013,58(2):395-398.

[12] Caro AA, Cederbaum AI. Role of cytochrome P450 in phospholipase A2- and arachidonic acid-mediated cytotoxicity[J]. Free Radic Biol Med, 2006,40(3):364-375.

[13] Zong H, Armoni M, Harel C, et al. Cytochrome P-450 CYP2E1 knockout mice are protected against high-fat diet-induced obesity and insulinresistance[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012,302(5):E532-539.

Establishment of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably over-expressing CYP2E1

XIONGYong-fu1,YANZai-hua,YANGZhao,LIJing-dong

(1NorthSichuanMedicalUniversity,Nanchong637000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a hepatocellular carcinoma cell line HepG2 which highly expressing CYP2E1 stably. MethodsThe coded sequence (CDS) of CYP2E1 was searched in NCBI website, and lentiviral vector (pLV(Exp)-Puro-CMVm- CYP2E1) was designed and constructed. 293T cells were co-transfected with the vector corresponding lentiviral packaging plasmid (pMDLg/pRRE, pRSV-REV and pMD2.G). Lentiviral (Lenti-Cyp2e1-eGFP-Puro) carrying CYP2E1 gene was used to trasfect HepG2 cell line, and puromycin-resistance screening were performed to establish the HepG2 cell line that highly expressed CYP2E1. The transfection was detected through enhanced green fluorescent protein, q-PCR and Western blotting was used to detect the expression of CYP2E1 mRNA and protein in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene. ResultsHepG2 cell line all transfected CYP2E1 gene successfully. The relative expression of CYP2E1 mRNA in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene was 1.02±0.06, 1.06±0.05 and 7.42±0.07, the protein expression of each group was 0.26±0.02, 0.29±0.01 and 1.61±0.08 respectively. HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene had significant differences as compared with the former two groups (all P<0.05).ConclusionThe hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably and highly expressing CYP2E1 gene is successfully constructed by lentiviral transfection.

Key words:CYP2E1 gene; lentiviral vector; liver carcinoma; HepG2 cells

(收稿日期：2014-12-24)

通信作者簡(jiǎn)介：李敬東(1970-)，男，教授，主要研究方向?yàn)楦闻K疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:lijingdong358@126.com

作者簡(jiǎn)介：第一熊永福(1989-)，男，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦伟┑幕A(chǔ)研究。E-mail:xyf-eva@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370531)。

中圖分類(lèi)號(hào)：R73

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)07-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.003