黎先偉 譯

迄今為止，無論花費(fèi)了多大的成本和努力，我們?nèi)詻]有建立一套有效的預(yù)防、控制和清除豬繁殖與呼吸綜合征（藍(lán)耳病，PRRS）的策略。不過，對我們獸醫(yī)工作者來說，掌握最佳的診斷方法來準(zhǔn)確的提前預(yù)判豬場藍(lán)耳病穩(wěn)定與否是非常重要的。目前，有什么工具和/或手段來協(xié)助我們呢？下面我們將一一闡述。

豬繁殖與呼吸綜合征是一種病毒性、災(zāi)難性的傳染病。其臨床表現(xiàn)為母豬嚴(yán)重的繁殖障礙、斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加等癥狀。豬藍(lán)耳病是一個全球性的問題，對世界養(yǎng)豬業(yè)和經(jīng)濟(jì)造成非常重要的影響。單單在美國，每年由于豬藍(lán)耳病對養(yǎng)豬業(yè)所造成的損失估計可達(dá)到6.64億美元。

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，研發(fā)和實(shí)施一種可靠的、準(zhǔn)確的和及時的診斷措施是有效防控豬藍(lán)耳病的一個重要組成部分。隨著診斷技術(shù)的日益發(fā)展，對于獸醫(yī)和養(yǎng)豬業(yè)的利益相關(guān)者來說，繼續(xù)采取最佳的措施以協(xié)調(diào)應(yīng)對疾病的發(fā)展，從而保持整個行業(yè)的穩(wěn)定是非常重要的。

一、選擇合適的診斷方法

選擇一種合適的豬藍(lán)耳病診斷方法最為關(guān)鍵的第一步是，確定實(shí)施檢測的目標(biāo)。這些目標(biāo)可能包括在一個群體中檢測出至少一頭受感染的動物；判斷病毒在群體中的流行情況；確定分離的是野毒還是疫苗毒，或評估感染的時間。這些因素將取決于待檢測的動物、需求樣品的數(shù)量以及合適組織的使用。此外，個別動物的檢測結(jié)果可能不能很好的反應(yīng)整個群體的狀態(tài)，因為每個動物感染的狀態(tài)都有所差異，所以我們在分析結(jié)果時必須多加注意。

二、選擇合適的樣本數(shù)

當(dāng)選擇合適的用于診斷豬藍(lán)耳病的樣本數(shù)時，需要考慮到多種因素。為了從一個群體中鑒定出至少一份陽性樣本，需要考慮的因素包括群體大小、群體內(nèi)疾病的預(yù)期流行率、所需確定性的程度，以及所采用的檢測方法的敏感性和特異性。

檢測的時機(jī)也是非常重要的，因為感染和免疫反應(yīng)的多種方面，包括病毒血癥、病毒釋放、抗體應(yīng)答和特征性病變僅會在特定的時間內(nèi)出現(xiàn)。

三、選擇合適的組織樣本

一般來說，診斷檢測大體分為兩類：病毒（抗原）檢測和病毒抗體檢測。病毒（抗原）檢測需要采集富含病毒的組織、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、胸腔液、精液、血液、唾液或環(huán)境樣本；而病毒抗體檢測則需要采集血液（血清）、唾液或肌肉滲出液等，以檢測抗藍(lán)耳病抗體的水平。因此，組織樣本的選擇取決于多種不同的因素，包括特定的檢測目的、所選擇的診斷方法和可用的設(shè)備。

四、診斷方法

自從發(fā)現(xiàn)豬藍(lán)耳病以來，人們已采用過各種不同的技術(shù)和/或方法來檢測豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）及其抗體，目前其中一些診斷技術(shù)和/或方法很少用于臨床診斷，這有多方面的原因：首先可能是這種方法更適用于實(shí)驗室；第二該方法需要耗費(fèi)過長的時間；第三成本昂貴或需要專業(yè)培訓(xùn)過的人員等等。在下本中，我們將簡要描述現(xiàn)在針對豬藍(lán)耳病主要采用的檢測技術(shù)，同時談及一些較為傳統(tǒng)的方法以闡明近幾年來診斷技術(shù)和/或方法已發(fā)展到什么程度。

五、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的檢測

病毒的檢測技術(shù)可對疾病感染的狀態(tài)作出一個很好的指示，不過這些技術(shù)和/方法往往主要作為實(shí)驗室研究的工具，因為它們的操作需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗人員、而且成本較高以及所需的時間較長。一旦從樣本中分離到病毒，可使用特定的細(xì)胞系通過一系列的感染和復(fù)制從組織樣本中擴(kuò)增病毒。另一種方法就是采用電子顯微鏡直接觀察病毒，不需要通過特定分子或抗體來識別病毒，這在描繪新病毒株方面具有重要的作用。目前，新型、快速和低成本的診斷技術(shù)（見下文描述）已被廣泛使用，這些技術(shù)對于常規(guī)和快速診斷具有更高的實(shí)用性和便捷性。

1.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。當(dāng)懷疑病毒具有垂直傳播的特性時，可選擇胎兒樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。該方法可用于快速的、特異的和高度敏感的從不同的組織（包括血清、精液、唾液、肺組織、淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體）和環(huán)境樣本中檢測豬藍(lán)耳病病毒。這個方法的主要步驟包括從組織樣本中抽提病毒RNA；RNA通過逆轉(zhuǎn)錄為DNA；DNA的PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增DNA的檢測。

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的缺點(diǎn)是組織樣本之間和動物之間感染后病毒的檢測會有差異。此外，RTPCR的高度敏感性可能會由于樣本受污染而出現(xiàn)假陽性，而特定的引物對一些容易變異的病毒往往容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

2.免疫組化（IHC）。免疫組化方法可用于從不同部位的組織（包括肺臟、淋巴結(jié)、胸腺、扁桃體、脾臟和腎臟）中檢測豬藍(lán)耳病病毒。簡單來說，先用福爾馬林固定組織樣本，隨后用針對病毒核衣殼的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。最后采用一種經(jīng)標(biāo)記的第二抗體通過顯微鏡直接觀察組織中是否存在病毒。雖然免疫組化具有高度的特異性（100%），但是其僅有中等的敏感性（67%）。不過，在固定的48h內(nèi)處理組織可有效改善免疫組化的敏感性。在感染早期，敏感性的程度是最高的；而在感染后期階段，敏感性的程度會逐漸下降，如感染后超過28d，更不用說感染后超過90d。雖然免疫組化可有效鑒別仔豬中垂直傳播的病毒，但是對于一些容易變異的病毒，這種方法往往難以達(dá)到理想的效果。

3.熒光抗體染色法（FA）。熒光抗體染色法，通常用于評估支氣管肺泡灌洗液（BALF）或新鮮/冰凍的肺組織的病毒感染情況，不過目前該方法臨床上較少使用。在該技術(shù)中，樣本直接用熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記來觀察病毒粒子。對于檢測豬藍(lán)耳病病毒來說，這種方法要比免疫組化法更為快捷和便宜，但是與免疫組化相比，熒光抗體染色法不能檢測病毒株的遺傳多樣性，而且不推薦在感染后期使用這種方法。此外，熒光抗體染色可能也存在假陽性的問題，這可能是由于原始抗體或高背景染色的特異性較差所造成的。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測在豬藍(lán)耳病病毒的診斷中是一種比較新的技術(shù)，盡管尚未得到廣泛的應(yīng)用，但是這種方法可快速、便捷的檢測出豬藍(lán)耳病病毒，而不需要專業(yè)的知識或設(shè)備。試紙條通過免疫層析法檢測血清或組織勻漿中的病毒。簡單來說，這種方法的原理是樣本中的病毒與針對豬藍(lán)耳病病毒特定蛋白的金標(biāo)單克隆抗體相混合，形成蛋白-抗體復(fù)合物聚集在試紙條內(nèi)。隨后用一種經(jīng)標(biāo)記的第二抗體檢測聚集的蛋白-抗體復(fù)合物。目前，這種方法暫時只適用于有限的病毒。

六、豬藍(lán)耳病病毒特異性抗體的檢測

血清中豬藍(lán)耳病病毒特異性抗體的檢測是診斷豬藍(lán)耳病最為常用的方法，此外，也可以用唾液樣本或肌肉滲出液來進(jìn)行檢測。在美國，自從2010年以來，采用唾液樣本來診斷豬藍(lán)耳病的比例大幅增加。

豬藍(lán)耳病病毒抗體的檢測是一個不斷發(fā)展的診斷學(xué)科。一些方法和/或技術(shù)與時間和資源問題有關(guān)，目前主要用于實(shí)驗室研究。這些方法和/或技術(shù)包括免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗法（IPMA），一種高度特異且敏感的方法，而且是首次報道用于豬藍(lán)耳病診斷的血清學(xué)方法。在這個試驗中，經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體檢測的受病毒感染的細(xì)胞中的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體富集于微孔板內(nèi)。隨后通過光學(xué)顯微鏡來評估陽性樣本。同樣，病毒中和（VN）會產(chǎn)生難以解釋的結(jié)果。

雖然抗體檢測可鑒定出新的豬藍(lán)耳病病毒感染，但是這不適于監(jiān)測以往受過感染的群體，因為這種方法無法區(qū)別這些是新感染、舊感染還是接種疫苗所產(chǎn)生的抗體。

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗是檢測豬藍(lán)耳病病毒抗體中最為常用的一種方法。2010年愛荷華州立大學(xué)的研究已證實(shí)，酶聯(lián)免疫吸附試驗的特異性可高達(dá)99.9%，敏感性也能達(dá)到98.8%。微孔表面覆蓋大量的豬藍(lán)耳病病毒融合（N）蛋白用來捕獲組織樣本中的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體，隨后用過氧化物酶標(biāo)記的抗體顯示捕獲的抗豬藍(lán)耳病病毒。

雖然酶聯(lián)免疫吸附試驗既快捷又方便，但這種方法也有其局限性。免疫反應(yīng)在動物和檢測抗體的水平之間通常是可變的，這不一定能反映病毒的毒力。此外，母源抗體和飼料中的抗體可能也會影響最終的結(jié)果。早期感染期間的可能會出現(xiàn)假陰性也是需要關(guān)注的一個問題。

2.熒光微球免疫分析法（FMIA）。熒光微球免疫分析法是一種多重版的酶聯(lián)免疫吸附試驗，即采用不同的染色熒光微球來捕獲多種抗豬藍(lán)耳病病毒抗體，隨后用熒光標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行標(biāo)記。這種技術(shù)可在單一的小樣本中同時檢測幾種不同的抗體。研究結(jié)果證實(shí)，熒光微球免疫分析法對血清樣本的敏感性和特異性分別可達(dá)到98%和95%。此外，眾所周知傳統(tǒng)的方法用于檢測唾液樣本的敏感性較低，但采用FMIA的敏感性和特異性則分別可達(dá)到92%和95%。而且對于早期感染的檢測，F(xiàn)MIA要比ELISA具有更高的敏感性。

3.間接免疫熒光試驗（IFA）。

間接免疫熒光試驗與免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗法相似，不同的是使用熒光標(biāo)記的第二抗體來檢測捕獲的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體。研究已表明，間接免疫熒光試驗具有較高的特異性，而敏感性則取決于多種不同的因素，包括用于捕獲抗體的細(xì)胞類型、實(shí)驗室條件和抗豬藍(lán)耳病病毒的抗原性。通常情況下，樣本進(jìn)行ELISA檢測之后再進(jìn)行間接免疫熒光試驗以排除假陽性的結(jié)果。此外，這種方法也可采用唾液和肌肉滲出液樣本來進(jìn)行試驗。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測技術(shù)除了可用于檢測病毒抗原以外，現(xiàn)在這種方法也可用于檢測豬藍(lán)耳病病毒抗體（采用病毒融合蛋白）。膠體金試紙條技術(shù)不僅低成本、快捷和方便使用，而且不需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。據(jù)報告，這種方法的敏感性和特異性分別可達(dá)到93%和98%。不過，這種方法還沒有被廣泛使用。

七、病毒分離株的特性

病毒分離株的特性對于管理者及時做出正確的決策來說往往是非常重要的，如決定是否需要把養(yǎng)殖場內(nèi)的動物轉(zhuǎn)移到另一個區(qū)域、跟蹤病毒的蔓延趨勢以及確定是否新的病毒株存在于豬群內(nèi)。分子生物學(xué)技術(shù)，包括RFLP和DNA序列分析要比傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確的分析豬藍(lán)耳病病毒的特異性。

八、序列分析

目前，病毒基因組的序列分析是鑒定豬藍(lán)耳病病毒最常選擇的方法。從血清和受感染組織的樣本中提取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，這可為病毒株的分析提供最可靠的數(shù)據(jù)。ORF5序列的高變區(qū)用于區(qū)分病毒株是最為可靠的，而且ORF5的全基因序列也常用于分析比對不同的病毒。不同病毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系可通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹來表示。這可有效反應(yīng)養(yǎng)殖場群體的感染水平，以監(jiān)測當(dāng)?shù)厝后w內(nèi)病毒株的變異情況。當(dāng)在群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)潛在的新變異病毒時必須引起高度重視。

九、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）診斷的未來

要想成功的從豬群中控制和清除豬藍(lán)耳病病毒的感染，我們需要采用常規(guī)監(jiān)測和疾病診斷相結(jié)合的方法。雖然一系列的診斷技術(shù)已有效地成為診斷豬藍(lán)耳病病毒的手段，但是對于所有的情況和動物，目前仍沒有一種檢測技術(shù)是100%可靠的。隨著新技術(shù)的不斷引入，人們?nèi)找嬉蟠_保在合適的時間點(diǎn)對合適的動物進(jìn)行合適的檢測，并采用合理的干預(yù)來優(yōu)化有效的管理措施，從而最大化的預(yù)防或控制疾病的暴發(fā)。（By Olivier Duran）