王寧

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喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制

王寧

（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

喹諾酮類抗菌藥物屬化學合成藥物，主要通過抑制菌體內DNA旋轉酶及拓撲異構酶IV活性，最終抑制DNA合成而發(fā)揮抗菌作用。依據藥物的化學結構、抗菌作用以及體內過程可將此類藥物分為一、二、三及四代。第一代為萘啶酸，第二代代表藥物為吡哌酸，氟奎諾酮類藥物為第三代，第四代又稱為新奎諾酮類。依據嗜水性又可分為親水性和疏水性兩類。各代之間抗菌譜、抗菌強度以及作用對象存在不同[1]。整體上看，奎諾酮類藥物抗菌譜廣、對革蘭陰性菌抗菌活性強、體內部分廣且劑型多樣化，在臨床抗感染過程中、尤其是多重耐藥菌治療中得到廣泛應用。但近年來，臨床分離菌株，尤其是大腸埃希菌對其耐藥率顯著提高。從分子水平上看，靶基因及非靶基因的多點突變，是大腸埃希菌針對奎諾酮類藥物耐藥的主要分子事件。從生化機理上看，細菌體內藥物累積濃度降低、藥物作用的靶酶或靶位點改變以及質粒介導耐藥，是耐藥的主要機制[2]。

1 細菌體內藥物累積濃度降低

Nikaido等人于1994年研究報道，大腸埃希菌針對奎諾酮類藥物耐藥，與菌體內藥物累積濃度減少有關[9]。國內方治平等人于2005年采用葡萄糖與能量抑制劑氰氯苯蹤分別作用于敏感及耐藥菌株后，通過熒光測定法檢測菌體內奎諾酮類藥物濃度，亦發(fā)現(xiàn)敏感菌株體內藥物濃度顯著高于耐藥菌株，且MIC差異為160-1280倍，亦證明累積濃度下降，是大腸埃希菌耐藥的關鍵環(huán)節(jié)之一。此種機制主要涉及細菌胞膜結構的改變以及外排系統(tǒng)的存在。

1.1 大腸埃希菌外膜通透性改變 膜孔蛋白為大腸埃希菌菌體外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)的一種，以三聚體鑲嵌在細胞外膜的脂質層中并和胞外相通，形成胞內胞外物質交換的通道。大腸埃希菌存在5種不同的膜孔蛋白，即ompC、ompF、PhoE、lamB及蛋白K，前三者孔徑大小分別為1.3nrn、2.4nm和1.2nm，其氨基酰序列及核苷酸序列非常相似，氨基酰序列中沒有連續(xù)10個以上的親水性氨基酰出現(xiàn)。耐藥性大腸埃希菌中常出現(xiàn)ompF減少或缺失現(xiàn)象[3]。膜孔蛋白組成的通道為是奎諾酮類藥物進入菌體內的主要途徑，其表達量減少或缺失引起菌體內藥物濃度降低，從而導致耐藥的發(fā)生。資料顯示，此種機制不能引起細菌高度耐藥，但有其他耐藥機制共存時，能明顯提高細菌耐藥程度。

1.2 存在主動外排系統(tǒng) 主動外排系統(tǒng)的存在，是大腸埃希菌多重耐藥的主要機制之一。Van等人于2000年發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌菌株存在多種外排泵，最為重要的是質子依賴型AcrAB-TolC系統(tǒng)，該系統(tǒng)可使菌株對有機溶劑、染料、去污劑以及多種抗菌藥物高度耐藥。Touze于2004年采用基因敲除法證實菌株缺失acrAB及tolC基因時，抗菌藥物敏感性大為提高，印證了Van等人的研究結果[14]。為探究AcrAB-Tolc系統(tǒng)的結構，Sennhauser、Fujihira等人采用定點突變的方法，對特殊位點氨基酰殘基進行替換研究。結果顯示該系統(tǒng)主要由三個部分組成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排轉運蛋白(AerB)和外膜通道蛋白(TolC)。AcrA、AerB和TolC以三聚體形式存在于大腸埃希菌的細胞膜上，其中AcrA位于周漿間隙中，兩端連接著AerB和TolC；AerB和TolC分別位于細胞內膜和外膜上。在無底物結合時，AcrAB-TolC三聚體結構比較穩(wěn)定。其通道開放或閉合取決與三聚體構象變化[17]。當胞內或周漿間隙內藥物分子與AerB結合時，其構像發(fā)生改變，隨之通過級聯(lián)放大效應，引起AerA和TolC構像改變，AcrB和Tolc相互接觸，外排通道開放。研究發(fā)現(xiàn)，藥物分子外排主要和H十相關聯(lián)，它們構成一個反向轉運蛋白。通道開放后，H十發(fā)生內流，藥物分子外排，最終降低菌體內藥物有效濃度，引起菌株耐藥。

2 藥物作用靶位的突變

奎諾酮類抗菌藥物主要作用靶位為DNA旋轉酶及拓撲異構酶IV。藥物間作用靶位存在差異。Hooper等人研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星等傳統(tǒng)奎諾酮藥物主要作用于DNA旋轉酶，環(huán)丙沙星、加替沙星等新型藥物可均衡作用于DNA旋轉酶及拓撲異構酶IV。DNA旋轉酶是由兩個A亞基(GyrA)和兩個B亞基(GyrB)組成四聚體，催化依賴于ATP的DNA負超螺旋，在DNA復制和轉錄的起始階段起重要作用?？Z酮類藥物通過與旋轉酶-DNA復合物結合而抑制DNA的斷裂-重接循環(huán)[4-5]。拓撲異構酶IV是由兩個C亞基(PartC)和兩個E亞基組成的四聚體，在DNA復制后期起重要作用。奎諾酮類抗菌藥物通過作用異構酶，從而干擾細菌的DNA復制、修復及轉錄等來殺菌。早年研究表明，大腸埃希菌基因組中存在奎諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)。該區(qū)定位于gyrA的5’末端67-106密碼子區(qū)域。該區(qū)域的單位點突變引起MIC水平升高，但不顯現(xiàn)耐藥表型。同時兩點以上突變，或者伴發(fā)有次要靶位突變時，可引起菌株針對奎諾酮類藥物顯著耐藥[6]。菌株來源不同，QRDR突變位點存在差異。總的來看，大腸埃希菌QRDR主要位點為gyrA內83位絲氨酸和87位天冬氨酸，以及parc內79位絲氨酸和53位天冬氨酸。瑞士的Casson等于2006年研究后發(fā)現(xiàn)GyrA中val7o突變?yōu)镾er、PartC中Ala81突變?yōu)門hr以及Glu84突變?yōu)镻ro均可引起大腸埃希菌對奎諾酮類耐藥。07年采用PCR-SSCP技術，對40株耐奎諾酮類大腸埃希菌進行研究。發(fā)現(xiàn)除常見氨基酰突變外，37株菌株尚存在Asp87突變?yōu)锳sn、Ala84突變?yōu)镻ro[7-9]。日本的Niwa發(fā)現(xiàn)，突變氨基酰種類，對于耐藥水平有一定的關系。其研究中揭示GyrA中QRDR中Asp突變?yōu)镚ly，可顯著增加耐藥水平。

3 質粒介導耐藥

大腸埃希菌針對奎諾酮類藥物耐藥機制，多歸于染色體靶位突變或多重藥物外排泵過度表達。近來研究表明，質粒介導的耐藥(PMQR)亦發(fā)揮著重要作用。（1）1998年Mart等人將來源于肺炎克雷伯菌UABI的pMG252轉化至其他菌株時，發(fā)現(xiàn)該質?？娠@著提高宿主菌對環(huán)丙沙星的耐藥水平，從而揭示了質粒介導菌株針對奎諾酮類藥物耐藥的機制[10]。后續(xù)研究探明，該機制涉及qnrA、aac(6’)-Ib-cr及qepA等基因參與，且不同基因在菌株中分布有所差異。qnrA為一段由657個核苷酸組成的開放讀碼框架，編碼218個氨基酸序列。該基因呈全球性流行，常定位于I類整合子In4家族上，其亞型也不斷發(fā)現(xiàn)。Tran等人2005年研究明確了Qnr的耐藥機制。該蛋白可先于奎諾酮類藥物特異性地與DNA旋轉酶或IV型拓撲異構酶結合，通過減少酶與藥物結合位點及改變酶蛋白構象，最終引起菌株耐藥[15]。（2）氨基糖苷轉移酶基因(aac(6’)-Ib)最早報道于1986年，現(xiàn)己有30多種相似基因型，主要介導菌株對氨基糖苷類藥物耐藥[11-13]。部分慶大霉素耐藥大腸埃希菌中可發(fā)現(xiàn)aae(6’)-Ib-cr存在。與aae(6’)-Ib相比，其5’端多了12個獨特的堿基對，同時存在多處點突變。Robiesek等人發(fā)現(xiàn)，當發(fā)生突變時，尤其是氨基酰序列中102位Trp突變?yōu)锳rg，同時179位AsP突變?yōu)門yr后，可引起宿主菌對部分奎諾酮類藥物耐藥。進一步研究表明，aac(6’)Ib-cr介導奎諾酮類耐藥，主要通過對奎諾酮類藥物哌嗪環(huán)上氨基氮原子進行乙?；饔脤崿F(xiàn)的[16]。（3）qepA是法國學者2007年發(fā)現(xiàn)的質?；?，可介導宿主菌對親水性奎諾酮類藥物低水平耐藥。同年，Yamane進一步明確了該基因的結構與功能。qepA由1536個核昔酰構成，編碼蛋白包括511個氨基酸，為質子依賴型外排蛋白。該基因介導奎諾酮類耐藥，主要通過QePA對親水性奎諾酮類藥物外排實現(xiàn)的[17]。（4）qnr、aac(6’)-Ib-cr及qepA均能夠介導低水平奎諾酮類藥物耐藥，三者作用機制、作用位點存在差異。aac(6’)-Ib-cr及qepA在大腸埃希菌中更為多見?；谌呖晒泊嬗谕毁|粒上，三者可共同參與大腸埃希菌針對奎諾酮類藥物的耐藥性。

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（2015–06–05）

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