黎四維　韓露　馬培　周新

腫瘤診斷的新希望
—循環(huán)游離DNA檢測(cè)

黎四維韓露馬培周新

作者單位：430071武漢市，武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心

游離DNA是指游離于細(xì)胞之外的一類(lèi)DNA，又稱為循環(huán)核酸，1947年由Mandel和Métais發(fā)現(xiàn)。腫瘤患者外周血DNA水平高于正常人，且血液中游離DNA具有腫瘤細(xì)胞DNA的特征。隨著腫瘤分子生物學(xué)的深入研究，血液中游離DNA定量分析已開(kāi)始應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等。本文從游離DNA的來(lái)源、特點(diǎn)、提取、檢測(cè)及臨床應(yīng)用方面對(duì)游離DNA及其在腫瘤中的重要作用做一綜述。

游離DNA；基因檢測(cè)；腫瘤

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.02.014

游離DNA是一種游離于血液或體液中的DNA。1947年，Mandel和Métais［1］首次報(bào)道了外周血中存在游離DNA，但這一發(fā)現(xiàn)并沒(méi)引起足夠的重視。在隨后30多年的時(shí)間中，人們先后在自身免疫性疾病和腫瘤中發(fā)現(xiàn)了游離DNA的存在。1994年，Vasioukhin［2］和Sorenson［3］等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征和胰腺癌患者外周血游離DNA中發(fā)現(xiàn)了RAS基因的突變，這一發(fā)現(xiàn)才引起人們足夠的重視。1996年，Nawroz等［4］又在腫瘤患者血漿游離DNA中發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星改變。隨著新的研究結(jié)果的不斷出現(xiàn)，醫(yī)學(xué)界對(duì)于腫瘤患者游離DNA的關(guān)注越來(lái)越多。

檢測(cè)血漿或血清中游離DNA可視為一種“液體活檢”，有益于開(kāi)展各種相關(guān)診斷，并能避免對(duì)腫瘤組織活檢的需要。以血液為檢測(cè)標(biāo)本，使重復(fù)采集檢測(cè)樣本成為了可能，從而有利于對(duì)疾病的發(fā)展及腫瘤的治療過(guò)程進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。雖然游離DNA同時(shí)反映了生理和病理過(guò)程，并非腫瘤特異性，但自從發(fā)現(xiàn)血液游離DNA含有腫瘤細(xì)胞DNA相同基因突變后，其在腫瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)等方面的潛在價(jià)值越來(lái)越受到關(guān)注。本文就游離DNA的來(lái)源、生物學(xué)特性、檢測(cè)方法及其在腫瘤診斷中的臨床應(yīng)用做一綜述。

1　游離DNA的來(lái)源及其特點(diǎn)

在健康人體內(nèi)，血漿中可以發(fā)現(xiàn)少量的游離DNA，片段主要在185～200 bp或其整數(shù)倍。健康人血漿中的游離DNA主要來(lái)源于凋亡細(xì)胞。除此之外，所有的活細(xì)胞都自發(fā)性的向血液中釋放DNA片段，這些DNA片段又稱為代謝性DNA片段。對(duì)于腫瘤患者外周血中游離DNA的來(lái)源，人們提出了幾種假設(shè)。腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞凋亡和壞死后釋放是其主要來(lái)源。腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌可能是其另一個(gè)潛在的來(lái)源。壞死和凋亡細(xì)胞主要被巨噬細(xì)胞或其他清道夫細(xì)胞吞噬。巨噬細(xì)胞吞噬壞死細(xì)胞后可以釋放消化的DNA到組織環(huán)境。體外的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)［5］結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞在釋放DNA的過(guò)程中可被激活或死亡，但細(xì)胞核酸的片段仍可以釋放到外周血中。血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移到骨髓或肝臟等處的腫瘤細(xì)胞也可以釋放出游離DNA，其大小主要分布在70～200 bp，大的片段則可達(dá)到10 000 bp以上。

血漿中腫瘤細(xì)胞釋放出游離DNA的多少，取決于腫瘤的性質(zhì)、大小等。此外，血液中游離DNA的含量也受到血液及淋巴循環(huán)對(duì)其清除、降解等的影響。血液中的游離DNA由肝臟和腎臟清除，其半衰期從15 min到幾個(gè)小時(shí)不等。有研究［6］顯示，某些形式的DNA較其他形式的半衰期更長(zhǎng)。把純化的DNA注入小鼠血液中，結(jié)果顯示雙鏈DNA較單鏈DNA在血液中存在的時(shí)間更長(zhǎng)，環(huán)狀的病毒DNA較線性DNA存活時(shí)間更長(zhǎng)。然而，不論片段大小及形態(tài)，游離DNA都能被快速有效的從血液中清除。

2　游離DNA的提取及其檢測(cè)方法

不同的實(shí)驗(yàn)室提取游離DNA的方法各有不同，也有許多商品化的試劑盒可供使用，但目前并沒(méi)有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)提取方法和純化步驟。許多試劑盒也沒(méi)有對(duì)樣本的分離、處理、分析進(jìn)行明確的說(shuō)明。目前，主要的提取方法有離子交換樹(shù)脂法、鹽析法和磁珠分離法等。

目前，對(duì)于采用血漿還是血清作為游離DNA提取的最佳樣本仍然存在爭(zhēng)議。由于不同實(shí)驗(yàn)室采用不同的試劑和提取方法，因而無(wú)法對(duì)各實(shí)驗(yàn)室間的提取結(jié)果進(jìn)行比較。從血漿中分離得到游離DNA較血清中少，這可能是因?yàn)槟梢源偈拱准?xì)胞釋放游離DNA。這種由白細(xì)胞釋放的DNA對(duì)游離NDA的定量或突變等的檢測(cè)均有影響。

游離DNA的定量檢測(cè)目前尚無(wú)統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)方法也很難達(dá)到一致。各種分析前因素，如血液的處理延遲、凝固、凍融、儲(chǔ)存溫度、患者的基本情況等均會(huì)對(duì)游離DNA的含量及完整性有很大的影響。長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，也會(huì)影響游離DNA的含量，Sozzi等［7］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血漿或DNA儲(chǔ)存在-80℃一年后，其DNA含量可下降約30%。但無(wú)論采用何種方法，如熒光為基礎(chǔ)的方法（如PicoGreen染色和紫外光譜法）或定量PCR法（如SYBR Green和TaqMan探針），均可檢測(cè)到腫瘤患者游離DNA較正常對(duì)照者升高［8］。

游離DNA的定性檢測(cè)按研究對(duì)象和目的不同可采用不同的方法，主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析聚合酶鏈反應(yīng)法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)法、測(cè)序分析和特異性引物延伸法，上述方法主要用于游離DNA未知突變的篩查、基因的遺傳多態(tài)性分析、分析有無(wú)對(duì)應(yīng)的已知突變等。如果采用游離DNA作為腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估及療效監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，進(jìn)行更多大樣本、多中心的臨床研究并建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法是很有必要的。

3　游離DNA的臨床應(yīng)用

3.1游離DNA突變檢測(cè)檢測(cè)游離DNA中腫瘤特異性的基因突變具有較好的臨床價(jià)值，如KRAS和TP53等這些在多種類(lèi)型腫瘤中具有高突變頻率的基因，其檢測(cè)對(duì)腫瘤的早期診斷具有重要的臨床意義。最近的一項(xiàng)研究［9］通過(guò)大規(guī)模的芯片篩查顯示，PIK3CA、TP53和GATA3三個(gè)基因突變占到全部乳腺癌基因突變的10%以上，其中Luminal A型乳腺癌最常見(jiàn)的突變?yōu)镻IK3CA基因（45%），其次是MAP3K1，GATA3、TP53、CDH1和MAP2K4。Luminal B型乳腺癌中TP53和PIK3CA基因突變均占總突變的29%；HER2E亞型乳腺癌中HER2基因擴(kuò)增達(dá)80%，此外TP53和PIK3CA的突變分別為72%和39%；basal-like型乳腺癌中TP53突變則達(dá)到80%以上。

針對(duì)游離DNA突變的檢測(cè)，需要突變位點(diǎn)在腫瘤具有以下特點(diǎn)：發(fā)生頻率高并具有腫瘤特異性。但是，突變往往發(fā)生頻率較低。此外，還應(yīng)考慮到正常細(xì)胞所釋放的DNA造成的干擾。通過(guò)血液游離DNA相對(duì)高發(fā)的基因突變的檢測(cè)，可以對(duì)相應(yīng)疾病進(jìn)行預(yù)警，并有利于進(jìn)一步對(duì)疾病進(jìn)行分型。

3.2腫瘤特異性的微衛(wèi)星改變游離DNA中發(fā)現(xiàn)的基因改變包括以PCR檢測(cè)為基礎(chǔ)的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）。由于LOH只在腫瘤患者中出現(xiàn)，健康人體內(nèi)不存在，因此其檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷具有重要的臨床意義。針對(duì)血清或血漿的游離DNA的LOH檢測(cè)方法均有報(bào)道，但結(jié)果之間存在很大的差異。這種差異一部分來(lái)自于游離DNA與腫瘤組織間的差異，主要是游離DNA中LOH發(fā)生率較低，另一部分則是方法本身的原因，包括技術(shù)原因和背景DNA（由正常細(xì)胞釋放的DNA）對(duì)腫瘤DNA的稀釋作用。此外，在炎癥或組織修復(fù)過(guò)程中，良性細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，血液中小片段的DNA增加，也影響LOH的檢測(cè)［10］。

Schwarzenbach等［11］報(bào)道在388例乳腺癌患者的術(shù)前血漿標(biāo)本中，檢測(cè)了8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中對(duì)短片段游離DNA的LOH檢出率為38%，而長(zhǎng)片段檢出率為28%，二者與腫瘤組織的一致性均為32.85%。這些LOH改變與腫瘤分期、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、孕激素受體陽(yáng)性及HER2受體具有相關(guān)性。此外，攜帶有D12S1725位點(diǎn)（與細(xì)胞周期蛋白D2相關(guān)）LOH的患者總生存期較不攜帶患者更短。同樣，Shaw等［12］也報(bào)道，盡管LOH在血漿與配對(duì)組織中的檢出率在不同患者差異很大，但LOH與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期間存在顯著相關(guān)。

目前LOH檢測(cè)存在的主要問(wèn)題是檢出率較低，且與組織標(biāo)本的符合率差異性較大。從技術(shù)上對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)有利于其在腫瘤診斷中的應(yīng)用。此外，多個(gè)LOH位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)也可提高腫瘤檢出率及檢測(cè)效率。

3.3表觀遺傳學(xué)改變表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下，通過(guò)某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表現(xiàn)型的變化。表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。通過(guò)評(píng)估游離DNA甲基化的水平來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)已成為一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。

為了提高分析的效能，從眾多已知的甲基化的基因中篩選出腫瘤相關(guān)基因至關(guān)重要。此外，表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤并不是一一對(duì)應(yīng)的，有些特定的腫瘤抑制基因，經(jīng)常在某些腫瘤中甲基化并且表達(dá)下調(diào)。Chimonidou等［13］用甲基化特異性PCR法檢測(cè)了123例乳腺癌患者CST6基因啟動(dòng)子甲基化情況，結(jié)果顯示49例（39.8%）乳腺癌患者游離DNA高甲基化，而健康個(gè)體均低甲基化。隨后，該團(tuán)隊(duì)還檢測(cè)了SOX17基因啟動(dòng)子在原發(fā)性乳腺癌患者中的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)55例早期乳腺癌患者中有19例高甲基化，59例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中有24例高甲基化，23例健康人中有1例甲基化［14］。同時(shí)，他們還檢測(cè)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞中甲基化的情況，結(jié)果表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞甲基化的情況與游離DNA之間存在相關(guān)性，從而也間接證明了游離DNA的來(lái)源。

3.4游離DNA完整性檢測(cè)近年來(lái)，游離DNA的完整性檢測(cè)逐漸成為研究的熱點(diǎn)。研究最多的是ALU和LINE1序列，他們最初被稱為“junk DNA”。近來(lái)的研究［15］表明，他們?cè)贒NA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)座子等生理過(guò)程中可能起到了重要的作用。完整性檢測(cè)主要是基于腫瘤壞死過(guò)程所釋放的DNA片段一般較長(zhǎng)，也就是DNA完整性較好，片段主要是200～400 bp大小之間，而正常人群游離DNA以凋亡為主，其DNA完整性較差。另一方面，由于ALU和LINE1序列分布在基因組的所有染色體上，因此在檢測(cè)時(shí)具有較高的靈敏度，但同時(shí)也相應(yīng)地降低了對(duì)腫瘤檢測(cè)的特異性。研究［16］表明，采用PCR技術(shù)檢測(cè)血漿游離DNA的完整性可作為預(yù)測(cè)早期乳腺癌的發(fā)展及微轉(zhuǎn)移（直徑≤1 mm的微小轉(zhuǎn)移灶，通常須經(jīng)病理組織學(xué)檢查方能診斷）的一項(xiàng)重要指標(biāo)。此外，游離DNA的完整性分析也被用于膀胱癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌等腫瘤的診斷中。

目前，對(duì)于游離DNA完整性的研究仍然較少，其是否可以作為多種腫瘤診斷的一個(gè)通用的生物學(xué)標(biāo)志物在臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步深入研究。

3.5病毒DNA檢測(cè)有些腫瘤中可發(fā)現(xiàn)病毒的游離DNA。例如，EB病毒（epstein-barr virus，EBV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV），分別是鼻咽癌、肝癌、子宮頸癌的發(fā)病原因之一。

這些特定的病毒DNA可以用來(lái)作為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物。已報(bào)道的游離DNA與腫瘤間存在相關(guān)性的有：EBV與霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌相關(guān)；HBV與某些類(lèi)型的肝細(xì)胞癌相關(guān)；HPV與子宮頸癌相關(guān)等。多個(gè)大樣本的研究［17，18］已證明，EBV游離DNA在鼻咽癌的診斷和預(yù)后判斷中具有重要的臨床價(jià)值。檢測(cè)EBV的游離DNA作為評(píng)估鼻咽癌惡性程度的一項(xiàng)指標(biāo)已在鼻咽癌的高發(fā)區(qū)—中國(guó)大陸、香港和臺(tái)灣地區(qū)廣泛開(kāi)展。病毒游離DNA檢測(cè)的一個(gè)主要局限性是良性的病毒感染患者游離病毒DNA水平也可升高，這對(duì)于臨床的診斷篩查具有一定的干擾。因此建立具有臨床診斷意義的cut-off值是很有必要的。

4　展望

檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)使得我們可以對(duì)游離DNA進(jìn)行分析。通過(guò)分析腫瘤患者和健康個(gè)體游離DNA的差異，為非侵入性腫瘤診斷方法提供了一種新的可能性。同時(shí)，我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，目前大量的病例對(duì)照研究顯示結(jié)果存在較大差異，因此將這一技術(shù)成功應(yīng)用于臨床仍需做更大量的研究及驗(yàn)證。特別是對(duì)于程序的標(biāo)準(zhǔn)化及標(biāo)準(zhǔn)的控制需要作出努力，從而為實(shí)驗(yàn)室成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用做好準(zhǔn)備。

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（本文編輯：李霦）

周新，E-mail：zhouxjyk@163.com

（2015-04-21）