木拉提·馬合木提, 袁留亞, 杜廣建, 張　濤,

艾克帕爾·阿布拉1, 艾尼瓦爾·牙生2

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 泌尿外科, 新疆 烏魯木齊, 830028;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿中心, 新疆 烏魯木齊, 830054)

草酸鈣腎結(jié)石患者腎臟組織中纖維黏連蛋白的表達(dá)及意義

木拉提·馬合木提1, 袁留亞1, 杜廣建1, 張濤1,

艾克帕爾·阿布拉1, 艾尼瓦爾·牙生2

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 泌尿外科, 新疆 烏魯木齊, 830028;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿中心, 新疆 烏魯木齊, 830054)

摘要:目的探討纖維連接蛋白(FN)在草酸鈣腎結(jié)石患者腎臟組織中的表達(dá)及意義。方法選取14例草酸鈣腎結(jié)石患者作為病例組，另選取同期因其他非腎結(jié)石原因接受腎臟切除的12例患者作為對(duì)照組。采用免疫組化染色法(S-P法)對(duì)2組患者進(jìn)行FN抗體染色。結(jié)果病例組中8例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組中只有2例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。2組FN表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論FN在草酸鈣腎結(jié)石患者腎臟組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

關(guān)鍵詞:纖維連接蛋白; 草酸鈣結(jié)石; 免疫組化

纖維連接蛋白(FN)是一種非膠原性的a2糖蛋白，目前研究[1]發(fā)現(xiàn)其作用有參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏連，維持細(xì)胞的正常形態(tài)、為細(xì)胞基質(zhì)再生起支架作用、促進(jìn)細(xì)胞遷移、對(duì)單核-巨噬細(xì)胞有趨化作用、參與止血與血液凝固、通過(guò)調(diào)理作用增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力等作用。有研究發(fā)現(xiàn)隨著腎間質(zhì)纖維化程度的加重，F(xiàn)N的表達(dá)隨之升高。本研究通過(guò)對(duì)草酸鈣腎結(jié)石腎臟組織FN 免疫組化染色，探討FN在草酸鈣腎結(jié)石腎臟組織中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2013年4—9月在本院接受經(jīng)皮腎鏡技術(shù)(PCNL)及開(kāi)放手術(shù)治療的14例草酸鈣腎結(jié)石患者作為病例組。另選取同期因其他非腎結(jié)石原因(腎臟外傷性破裂、腎臟腫瘤、腎盂輸尿管交.界處狹窄至腎臟積水無(wú)功能)接受腎臟切除的12例患者作為對(duì)照組。所有入選者均知情同意，且本研究得到新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2　方法

采用兔抗人FN多克隆抗體和SP試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接法(S-P法)，具體步驟參照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色步驟說(shuō)明進(jìn)行。免疫組化染色過(guò)程中，每例均以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，以正常腎皮質(zhì)組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

免疫組化分析FN染色陽(yáng)性結(jié)果判定請(qǐng)病理科專家判讀。FN主要定位于腎臟皮質(zhì)組織的細(xì)胞外基質(zhì)。光鏡下(400倍)隨機(jī)觀察3個(gè)高倍視野，根據(jù)著色強(qiáng)度的多少進(jìn)行評(píng)分，未無(wú)未著色記為陰性(-)，弱陽(yáng)性(淺棕色)記為(+)，中等陽(yáng)性(棕色)性記為(2+)，強(qiáng)陽(yáng)性(深棕色)性記為(3+)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間兩兩比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

病例組中8例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其中(-)2例，(+)4例，(2+)6例，(3+)2例，陽(yáng)性細(xì)胞外基質(zhì)表現(xiàn)為棕色或深棕色著色；對(duì)照組中只有2例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其中(-)6例，(+)4例，(2+)1例，(3+)1例。病例組FN的陽(yáng)性表達(dá)程度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=44,P=0.032)。

3討論

泌尿系結(jié)石是一種世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其中草酸鈣及含草酸鈣的泌尿系結(jié)石約占85%。其病因仍未完全明確，目前發(fā)現(xiàn)與生活習(xí)慣、自然環(huán)境、遺傳等因素密切相關(guān)，發(fā)病有明顯的地區(qū)差異和種族差異[2-4]。研究[5]顯示草酸鈣結(jié)石可能是由于基因變異與其他因素綜合作用而形成的最常見(jiàn)的結(jié)石。

FN是一種單基因編碼組成的多功能糖蛋白，分子量230 KD，其基因定位于人類染色體2q34～36, Patel證明約有50個(gè)外顯子。除少數(shù)例外，基因上的外顯子與蛋白肽鏈中的重復(fù)序列相對(duì)應(yīng)。既往研究[4]中，尿中檸檬酸鹽和鎂這兩種離子抑制劑和大分子化合物TH蛋白、酸性黏多糖、腎鈣素、骨橋蛋白和纖維連接蛋白等非離子大分子被認(rèn)為可能是腎結(jié)石的保護(hù)因素。FN主要由成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成和分泌，也可由血漿FN轉(zhuǎn)化而來(lái)。FN是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的調(diào)理素，具有止血、抗血栓、促進(jìn)細(xì)菌黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和增殖、增進(jìn)細(xì)胞連接、促進(jìn)組織修復(fù)等功能，其最重要和最根本的功能特性是參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏連[6]。纖維連接蛋白能夠結(jié)合纖維蛋白及纖維蛋白原，是其他膠原沉積于腎小管和間質(zhì)的先決條件之一，可能是作為這些細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的中心環(huán)節(jié)而起作用，同時(shí)纖維連接蛋白也是一種重要的調(diào)理介質(zhì)，其通過(guò)與整合素的結(jié)合在介導(dǎo)細(xì)胞增殖與器官硬化過(guò)程中起著重要作用[7]。FN還對(duì)成纖維細(xì)胞具有化學(xué)趨動(dòng)作用和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基質(zhì)作用[8]，能吸引成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)定向遷移，促進(jìn)肉芽組織向創(chuàng)傷區(qū)生長(zhǎng)，以增生修復(fù)損傷的組織結(jié)構(gòu)。當(dāng)腎小管上皮受損時(shí)晶體易在其表面成核和生長(zhǎng)，可能是草酸鈣結(jié)石最初成核部位[9-10]。體外研究[11-12]表明，F(xiàn)N可以結(jié)合到草酸鈣晶體表面，通過(guò)抑制草酸鈣晶體的內(nèi)吞和草酸鈣晶體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的黏附作用，從而抑制草酸鈣結(jié)石的形成，因此被認(rèn)為是尿液中草酸鈣結(jié)石的主要抑制因子之一。

本研究中，病例組腎組織中FN的表達(dá)明顯較對(duì)照組增高，說(shuō)明草酸鈣結(jié)石可以刺激FN的過(guò)度分泌，從而抑制草酸鈣結(jié)石的進(jìn)一步形成。國(guó)外學(xué)者[13-14]也曾發(fā)現(xiàn)在不活動(dòng)的復(fù)發(fā)性結(jié)石患者中，草酸鈣結(jié)晶可以刺激腎小管過(guò)度分泌FN，且作用強(qiáng)度與FN的量有關(guān)。在草酸鈣晶體的刺激下腎小管上皮細(xì)胞的不同基因可能變異，這些基因的變異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生改變[15]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中只有2例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，6例不表達(dá)FN，而在病例組腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)中8例為中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。雖然FN具有抑制結(jié)石形成和生長(zhǎng)的作用，但草酸鈣晶體形成過(guò)多時(shí)，F(xiàn)N可能失去了抑制草酸鈣晶體的作用。這也反映了這一階段FN不斷增加、沉積，并發(fā)生細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的生物學(xué)效

應(yīng)，使細(xì)胞和膠原、纖維蛋白等結(jié)合更加緊密，加重了腎臟實(shí)質(zhì)的纖維化。這可能是草酸鈣晶體刺激引起FN表達(dá)過(guò)高，從而引起腎纖維化[16]。

參考文獻(xiàn)

[1]程紅新, 楊曉萍, 蔣雅紅, 等. 纖維連接蛋白在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2012, 16(31): 5837.

[2]De Yoreo J J, Qiu S R, Hoyer J R. Molecular modulation of calcium oxalate crystallization[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2006,291(6):F1123.

[3]Kumar V, Lieske J C. Protein regulation of intrarenal crystallization[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens,2006,15(4):374.

[4]Onaran M, Yilmaz A, Sen I, et al. A HindIII polymorphism of fibronectin gene is associated with nephrolithiasis[J]. Urology,2009,74(5):1004.

[5]Sayer J A. The genetics of nephrolithiasis[J]. Nephron Exp Nephrol,2008,110(2):e37.

[6]Ekblom P. Formation of basement membranes in the embryonic kidney: an immunohistological study[J]. J Cell Biol,1981,91(1):1.

[7]Li J H, Zhu H J, Huang X R, et al. Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF-Beta on renal tubular epithelial cells by blocking Smad2 activation[J]. J Am Soc Nephrol,2002,13(6):1464.

[8] Seppa H E, Yamada K M, Seppa S T, et al. The cell binding fragment of fibronectin is chemotactic for fibroblasts[J]. Cell Biol Int Rep,1981,5(8):813.

[9]姚秀瓊, 楊如娥, 鄧穗平．近端腎小管上皮細(xì)胞損傷后對(duì)草酸鈣結(jié)晶的促進(jìn)作用[J]. 中華泌尿外科雜志, 2011, 32(1): 7.

[10]Chen S, Gao X, Sun Y, et al. Analysis of HK-2 cells exposed to oxalate and calcium oxalate insights into the molecular mechanisms of renal injury and stone formation[J].Urol Res, 2010, 38: 7.

[11]Tsujihata M, Yoshimura K, Tsujikawa K, et al. Fibronectin inhibits endocytosis of calcium oxalate crystals by renal tubular cells[J]. Int J Urol,2006,13(6):743.

[12] Avila J J, Lympany P A, Pantelidis P, et al. Fibronectin gene polymorphisms associated with fibrosing alveolitis in systemic sclerosis[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(1):106.

[13]Tsujihata M, Miyake O, Yoshimura K, et al. Comparison of fibronectin content in urinary macromolecules between normal subjects and recurrent stone formers[J]. Eur Urol,2001,40(4):458.

[14]Tsujihata M, Miyake O, Yoshimura K, et al. Fibronectin as a potent inhibitor of calcium oxalate urolithiasis[J]. J Urol,2000,164(5):1718.

[15]Miyazawa K, Aihara K, Ikeda R, et al. cDNA macroarray analysis of genes in renal epithelial cells exposed to calcium oxalate crystals[J]. Urol Res,2009,37(1):27.

[16]朱恒梅, 祝勝郎, 陳結(jié)慧,等. 多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖致大鼠腎臟系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)沉積中的作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2012, 31(9): 8.

Expression and significance of fibronectin in kidney tissue of patients with calcium oxalate nephrolith

MULATI Mehmut1, YUAN Liuya1, DU Guangjian1, ZHANG Tao1,

AIKEPAER Abula1, AINIWAER Yasheng2

(1.DepartmentofUrinarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedical

University,Urumqi,Xinjiang, 830028; 2.UrinaryCenter,TheFirstAffiliated

HospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang, 830054)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of fibronectin (FN) in kidney tissue of patients with calcium oxalate nephrolith. MethodsA total of 14 patients with calcium oxalate nephrolith were enrolled into medical case group and another 12 patients in the same period underwent nephrectomy were selected as control group. FN antibody was stained in both groups by immunohistochemistry staining (S-P method). ResultsThere were 8 patients with median to strong positive expression in the medical case group and 2 patients in the control group. There was significant difference of FN expression between the two groups (P<0.05). ConclusionFN can express strongly and positively in patients with calcium oxalate nephrolith.

KEYWORDS:fibronectin; calcium oxalate nephrolith; immunohistochemistry

通信作者:艾尼瓦爾·牙生, E-mail: mekit@126.com

基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(201211A048)

收稿日期:2014-12-19

中圖分類號(hào):R 692.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)05-146-02DOI: 10.7619/jcmp.201505054