劉新亮蔡金峰王歡利曹福亮( 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心( 南京林業(yè)大學(xué)) ，南京，210037)

植物硬脂酰-ACP 去飽和酶(Stearoyl-acyl carrier protein (ACP)desaturases，SADs，EC 1．14．99．6)是細(xì)胞核編碼的、存在于細(xì)胞質(zhì)體中的一類脫氫酶，廣泛存在于植物細(xì)胞中，是植物中唯一已知的可溶性脫飽和酶家族［1-3］。Δ9硬脂酰-ACP 去飽和酶(SAD)是目前植物中研究最廣泛的一種硬脂酰-ACP 脫飽和酶，催化硬脂酸脫氫形成第一個(gè)雙鍵，從而使其去飽和形成單不飽和油酸(C18:1)，完成十八碳不飽和脂肪酸合成的第一步去飽和反應(yīng)，其功能已在多種植物中得到驗(yàn)證［4-7］。SAD 是脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，也是調(diào)控膜脂與貯脂中飽和與不飽和脂肪酸比例的關(guān)鍵酶［8］。而不飽和脂肪酸參與植物體內(nèi)多種代謝，特別與植物低溫抗性有關(guān)，植物不飽和脂肪酸含量的增加可顯著提高植物的低溫適應(yīng)性［9-10］。

銀杏(Ginkgo biloba)的溫度適應(yīng)范圍較廣，在我國(guó)丹東市亦能正常生長(zhǎng)(年平均氣溫8．5 ℃)，具有較強(qiáng)的低溫適應(yīng)能力，是進(jìn)行抗逆機(jī)理研究的理想樹種［11］。銀杏GbSAD 基因的全長(zhǎng)cDNA 已得到克隆，編碼一個(gè)包含412 個(gè)氨基酸殘基的多肽序列，預(yù)測(cè)分子量為 47 kDa (Genbank 登錄號(hào):HQ694561)［12］。為探討GbSAD 基因?qū)に亟閷?dǎo)的信號(hào)通路和高鹽條件的響應(yīng)機(jī)制，筆者懸浮培養(yǎng)了銀杏愈傷組織細(xì)胞系，采用熒光定量PCR 分析GbSAD 基因在不同激素及鹽脅迫條件下的表達(dá)模式，以期探討其對(duì)激素介導(dǎo)信號(hào)通路的響應(yīng)機(jī)制。另外，筆者成功地將GbSAD 構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究GbSAD 酶學(xué)特性及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試材為人工授粉的同一母株上的一批種子，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮后，于超凈臺(tái)上70%酒精浸泡1 min，10%次氯酸鈉消毒15 min。剖開種子取出子葉，切成大小均一的小塊(約2 mm 長(zhǎng))，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面(MS+1．5 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA)。每瓶接種5 塊，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度25 ℃，每20 d 轉(zhuǎn)接1 次。繼代培養(yǎng)2 次后，將長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的愈傷組織轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MS 液體培養(yǎng)基(MS+1．5 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA)的三角瓶中，每瓶愈傷組織接種量控制在3 ～4 g，25 ℃，100 r·min-1光照振蕩培養(yǎng)。每7 d 繼代一次，第2次轉(zhuǎn)接正常培養(yǎng)48 h 后，開始進(jìn)行脅迫處理，處理時(shí)間為0(對(duì)照)、3、6、12、24、48、72 h，每個(gè)處理取3瓶，紗布過濾后，液氮速凍-80 ℃保存。在前人研究的基礎(chǔ)上，通過預(yù)試驗(yàn)將激素處理濃度分別設(shè)為100 μmol·L-1脫落酸(ABA)、100 μmol·L-1水楊酸(SA)、40 μmol·L-1乙烯利(ETH)、100 μmol·L-1茉 莉 酸 甲 酯(MeJA)、100 mmol · L-1氯 化 鈉(NaCl)［13-16］。用于組織表達(dá)的根、莖、葉取自同一個(gè)2 年生銀杏無性系，柱頭及雄蕊于2014 年4 月采自南京林業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)林場(chǎng)。

1．1 GbSAD 基因熒光定量PCR

采用柱式植物總RNA 抽提純化試劑盒(上海生工)分別提取銀杏愈傷組織各處理總RNA，并提取各組織總RNA。參照Xu 等［17］選擇GAPDH(Genbank 登錄號(hào):L26924)為內(nèi)參基因，以各處理cDNA為模板檢測(cè)GbSAD 基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。Real-Time PCR 反應(yīng)試劑由SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒(TAKARA)提供，在ABI PRISM 7500 Real-Time PCR 儀上進(jìn)行定量擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt方法［18］分析試驗(yàn)結(jié)果，所用引物見表1。

表1 熒光定量PCR 引物及表達(dá)載體重組引物

1．2 GbSAD 蛋白序列分析及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

應(yīng)用ORF Finder 進(jìn)行在線ORF 分析并推導(dǎo)出GbSAD 氨基酸序列。在http:blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast 上進(jìn)行序列比對(duì)和同源基因查詢，應(yīng)用DNAMAN V6．0 軟件對(duì)序列一致性進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)GbSAD 基因全長(zhǎng)引物GbSADU、GbSADD(表1)，以上述葉片cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)。根據(jù)GbSAD 基因全長(zhǎng)序列及一步法定向克隆試劑盒(ClonExpressTMII One Step Cloning Kit，Vazyme)說明書設(shè)計(jì)表達(dá)載體引物GbSADS、GbSADA(表1)，以得到的基因全長(zhǎng)cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增獲得含有載體同源序列的GbSAD 基因序列，與經(jīng)過BamH I 酶切的線性化表達(dá)載體pET-32a(+)連接，獲得重組表達(dá)載體pET32a-GbSAD。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落活化培養(yǎng)，選取菌液PCR 結(jié)果與產(chǎn)物大小一致的單菌落抽提質(zhì)粒，通過PCR、EcoR V 和Xho I 雙酶切篩選陽性克隆，并對(duì)陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。采用熱激法將構(gòu)建成功的pET32a-GbSAD 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株系BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，將空載pET32a(+)轉(zhuǎn)入BL21(DE3)作為陰性對(duì)照。

1．3 原核表達(dá)的SDS-PAGE 及Western Blot 分析

挑取測(cè)序正確的單克隆BL21(DE3)接種到2 mL LB(50 μg·mL-1Amp)培養(yǎng)基中，160 r/min 37 ℃培養(yǎng)6 h 后，取200 μl 加入20 mL LB(50 μg·mL-1Amp)培養(yǎng)基中，37 ℃160 r/min 培養(yǎng)至OD600為0．5～0．6 時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度1 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在37 ℃誘導(dǎo)2、6、24 h 后收集菌液。按照朱旭芬［19］的方法制備上清及沉淀(宿主菌BL21 細(xì)胞)樣品。取上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)，并用考馬斯亮藍(lán)R250 染色檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，用Quantity One 軟件分析表達(dá)蛋白分子量。SDS-PAGE 電泳后將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(0．45 μm)上，單抗(TRUE-Tag Anti-His mAB，Vazyme)、二抗(HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，Vazyme)孵育標(biāo)記，Enhanced ECL (Vazyme)反應(yīng)1 min，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2．1 GbSAD 基因的表達(dá)

為研究銀杏GbSAD 基因?qū)Ω鞣N非生物脅迫的應(yīng)答，采用實(shí)時(shí)RT-PCR 分析了其在ABA、SA、Me-JA、ETH 以及NaCl 處理下的表達(dá)模式，設(shè)置相對(duì)表達(dá)量變化2 倍作為基因受到調(diào)控的閾值［20］。結(jié)果表明，GbSAD 基因受到多種非生物脅迫的調(diào)控(表2)。在ABA 處理?xiàng)l件下，該基因受誘導(dǎo)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，6 到12 h 時(shí)變化較明顯，12 h 時(shí)表達(dá)量為6 h 時(shí)的2．1 倍，但與對(duì)照相比差異并未達(dá)到基因受調(diào)控的閥值。在SA 處理?xiàng)l件下，GbSAD 基因的相對(duì)表達(dá)量在誘導(dǎo)前期明顯下降，至6 h 時(shí)達(dá)到最小值，明顯低于對(duì)照，為對(duì)照的0．1 倍;隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，基因的相對(duì)表達(dá)量開始上升，24 h 時(shí)表達(dá)量為12 h 時(shí)的9．7 倍，且顯著高于對(duì)照;誘導(dǎo)后期的表達(dá)量降低至對(duì)照水平。在外源MeJA 和ETH 處理?xiàng)l件下，GbSAD 的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)較為一致，但GbSAD被誘導(dǎo)的相對(duì)表達(dá)量未達(dá)到閾值，說明GbSAD 基因并沒有受到這兩個(gè)激素的誘導(dǎo)。NaCl 處理期間，GbSAD 的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在6 h 時(shí)降到對(duì)照的0．45 倍，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)維持在較穩(wěn)定的水平。GbSAD 基因的組織表達(dá)分析表明，GbSAD 在各個(gè)組織中均有表達(dá)，葉中表達(dá)量最高(1．01±0．24)，其次是雌花(0．77±0．09)，雄花為(0．12±0．01)，根(0．08±0．01)和莖(0．08±0．03)中表達(dá)量最少。

2．2 GbSAD 蛋白序列

通過DNAMAN 軟件將銀杏GbSAD 基因編碼的氨基酸序列與其他植物硬脂酰-ACP 去飽和酶序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)銀杏GbSAD 氨基酸序列與其他被子植物的序列相似度較高，表明GbSAD 在進(jìn)化上具有較高的保守性。GbSAD 與無油樟AtSAD 序列一致性最高，達(dá)到80．1%，與鱷梨、葡萄、巨桉、澳洲堅(jiān)果、胡楊、茸毛煙草、烏桕、美國(guó)白蠟同樣具有較高的同源性，分別為78．2%、79．0%、78．2%、78．2%、78．0%、77．4%、77．0%、76．2%(圖1)。在銀杏GbSAD 氨基酸序列中，包含兩個(gè)保守多肽序列DETGASP 和DYADILE(圖1 下劃線標(biāo)記的氨基酸)。

圖1 GbSAD 與其他植物SAD 氨基酸同源序列比對(duì)

表2 GbSAD 基因在不同處理時(shí)間和非生物脅迫下表達(dá)量的變化

2．3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)

2．3．1 重組質(zhì)粒pET32a-GbSAD 的構(gòu)建及鑒定

以GbSAD 基因全長(zhǎng)cDNA 為模板，用引物Gb-SADS 和GbSADA 進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小約為1．2 kb的cDNA 編碼區(qū)序列。電泳檢測(cè)結(jié)果表明與預(yù)期大小相一致，且無特異擴(kuò)增條帶(圖2)。利用Eco R V和Xho I 對(duì)重組子pET32a-GbSAD 雙酶切檢驗(yàn)，電泳結(jié)果如圖2 所示，酶切產(chǎn)物與PCR 產(chǎn)物大小一致。將目的條帶測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果正確，表明pET32a-GbSAD 原核表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

圖2 GbSAD 基因PCR 結(jié)果和重組質(zhì)粒pET32a-GbSAD 酶切檢測(cè)

2．3．2 目的蛋白的SDS-PAGE 分析

重組質(zhì)粒pET32a-GbSAD 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，用IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET32a-GbSAD 產(chǎn)生了一條約59 kDa 的條帶，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體均未出現(xiàn)這條蛋白帶(圖3)。37 ℃160 r/min 培養(yǎng)條件下，通過對(duì)比不同IPTG 誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)現(xiàn)，目的蛋白的表達(dá)量在誘導(dǎo)2 h 后即可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)且其表達(dá)量隨著時(shí)間的增加有下降趨勢(shì)。

2．3．3 目的蛋白的可溶性及Western Blot 檢測(cè)

經(jīng)SDS-PAGE 分別電泳檢測(cè)上清和沉淀發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)2 h 產(chǎn)生的目的蛋白在上清及宿主菌細(xì)胞中(沉淀)都有存在，表明GbSAD 經(jīng)誘導(dǎo)形成了可溶性融合蛋白(圖4-A)。目的蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，誘導(dǎo)產(chǎn)生的表達(dá)增強(qiáng)的59 KDa 蛋白質(zhì)條帶，表現(xiàn)出對(duì)His-6 抗原的陽性反應(yīng)，說明銀杏GbSAD 能夠在BL21-pET32a(+)表達(dá)體系中表達(dá)出目的蛋白(圖4-B)。

圖3 銀杏GbSAD 基因在大腸桿菌中的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)調(diào)控過程，全基因組分析的最新進(jìn)展揭示這一過程是通過控制全體基因表達(dá)、蛋白質(zhì)修飾和代謝組分實(shí)現(xiàn)的，涉及到一系列的生理生化反應(yīng)［21-22］。植物的膜系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系，外界溫度的變化直接影響膜結(jié)構(gòu)變化，細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的破壞是植物在低溫脅迫中造成傷害的重要原因。生物膜對(duì)低溫脅迫的相變溫度主要是由膜脂的脂肪酸組成及其相對(duì)含量決定。SAD 是提高植物體內(nèi)不飽和脂肪酸含量的關(guān)鍵酶，不飽和脂肪酸含量的增加可顯著提高植物的低溫適應(yīng)性。Byfield 等［23］觀察不同大豆品種種子萌發(fā)的過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，低溫明顯提高了SAD基因的表達(dá)水平，而高溫條件下，硬脂酸含量增加，SAD 基因的表達(dá)量顯著減少。De Palma 等［24］在研究馬鈴薯的耐冷性時(shí)認(rèn)為SAD 基因能夠提高不飽和脂肪酸的含量，從而提高植株的耐冷性。因此，可以通過調(diào)控SAD 基因的表達(dá)水平來增加植物體內(nèi)不飽和脂肪酸含量，從而增加植物對(duì)低溫的適應(yīng)能力［25］。除此之外，SAD 還有可能參與植物的衰老調(diào)節(jié)、抗真菌感染和機(jī)械損傷等調(diào)控過程［26-27］。低溫能顯著的提高SAD 基因的表達(dá)水平，這在銀杏中GbSAD 基因也表現(xiàn)為同樣的表達(dá)模式［12］。目前尚沒有直接證明表明GbSAD 基因與銀杏的抗寒性有關(guān)，其在非生物脅迫應(yīng)答中的功能還不清楚。研究不同處理?xiàng)l件下GbSAD 的表達(dá)情況，對(duì)探討其對(duì)激素和環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制具有重要意義。

圖4 融合蛋白GbSAD 的可溶性檢測(cè)及Western Blot 分析(誘導(dǎo)2 h)

植物通過激素傳遞的信號(hào)來調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)，是其適應(yīng)外界環(huán)境變化的策略之一。植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，從基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來看，可分為脫落酸(ABA)依賴型和非依賴型兩大途徑［28］。在植物中，由水楊酸(SA)、茉莉酸(MeJA)和乙烯利(ETH)介導(dǎo)的信號(hào)通路已被識(shí)別，這些信號(hào)通路主要由各種脅迫引起的防御反應(yīng)誘導(dǎo)，旨在增加抗菌化合物的積累和防御相關(guān)基因的表達(dá)［29］。其中，SA 和JA介導(dǎo)的調(diào)控通路呈現(xiàn)出拮抗趨勢(shì)，而JA 和ETH 介導(dǎo)的調(diào)控通路通常表現(xiàn)為協(xié)同作用［30］。有研究表明，在擬南芥突變株ssi2/fab2 中，SAD 基因功能的喪失降低了植株油酸(C18:1)含量，進(jìn)而引起由SA和JA 介導(dǎo)的防御反應(yīng)，油酸的減少誘導(dǎo)了SA 依賴型的逆境脅迫調(diào)控通路，抑制了JA 依賴型的調(diào)控通路［26］。本研究結(jié)果表明，GbSAD 的表達(dá)不受外源ABA 的誘導(dǎo)，屬于ABA 非依賴型的逆境脅迫調(diào)控通路;而外源SA 明顯的改變了GbSAD 基因的相對(duì)表達(dá)量，處理過程中相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升趨勢(shì)，說明銀杏GbSAD 基因可能參與了SA 介導(dǎo)的調(diào)控通路。在外源MeJA 和ETH 處理下，GbSAD 的表達(dá)水平并未發(fā)生明顯變化。GbSAD 基因在高鹽(NaCl)脅迫中后期，表現(xiàn)為低水平的表達(dá)模式，但是下降幅度并不大，這說明GbSAD 基因可能不受高鹽脅迫誘導(dǎo)，其表達(dá)量的下降可能是鹽脅迫下愈傷組織生長(zhǎng)勢(shì)減弱的原因。GbSAD 在各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中葉中表達(dá)量最高，根和莖中表達(dá)量最低，這種顯著的組織特異性說明該基因可能在特定的發(fā)育過程或生理活動(dòng)中發(fā)揮作用。

由于銀杏高效再生體系尚未建立，GbSAD 基因功能的研究只能通過異源表達(dá)進(jìn)行間接研究。原核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、經(jīng)濟(jì)快捷等優(yōu)點(diǎn)，為研究GbSAD 蛋白的表達(dá)和功能提供了一條有效的途徑。在野生型大腸桿菌中并不存在脂肪酸去飽和酶，其不飽和脂肪酸的合成主要依賴厭氧途徑。Cao 等［31］的研究實(shí)現(xiàn)了擬南芥SAD 基因在大腸桿菌(BL21)中的表達(dá)，并且在沒有添加外源輔助因子的情況下，異源表達(dá)蛋白具有脂肪酸脫飽和活性，這為研究GbSAD 蛋白的功能提供了參考。本研究結(jié)果表明，GbSAD 蛋白能夠與His 標(biāo)簽蛋白形成融合蛋白，在1 mmol·L-1IPTG 的誘導(dǎo)下，培養(yǎng)2 h 即能實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高效表達(dá)。Wang 等［12］預(yù)測(cè)GbSAD蛋白為分泌蛋白，本試驗(yàn)在上清中檢測(cè)到該目的蛋白，可推測(cè)該融合蛋白是以分泌蛋白的形式分泌至胞外。GbSAD 蛋白在誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h 時(shí)即可高效表達(dá)，且2 h 后表達(dá)量明顯降低，可能由于這種膜蛋白的大量表達(dá)對(duì)大腸桿菌有一定的毒害作用，限制了大腸桿菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響了其表達(dá)量。另外，SDSPAGE 檢測(cè)融合蛋白大小約59 kDa，略低于融合蛋白預(yù)測(cè)大小64 kDa(GbSAD 蛋白預(yù)測(cè)分子量47 kDa，載體自帶標(biāo)簽序列預(yù)測(cè)蛋白分子量17 kDa)，這可能與蛋白翻譯后修飾及凝膠電泳所產(chǎn)生的誤差有關(guān)。誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度等因子都能影響外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)，在試驗(yàn)中可進(jìn)一步優(yōu)化GbSAD 的原核表達(dá)體系，獲取較高濃度和純度的活性蛋白，為GbSAD 蛋白酶學(xué)特性的研究、抗體的制備及其功能的研究奠定基礎(chǔ)。

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