陶燕藍 潘曉晴 孔梅 藍增全 吳田

摘要：研究比較了濃硫酸預處理不同時間對3種楊梅種子離體條件下發(fā)芽率的影響，為建立楊梅組織培養(yǎng)快繁體系奠定基礎。結果表明：云南野生楊梅種子在不用濃硫酸處理下的發(fā)芽率最高，達8333%；荸薺種和東魁2種楊梅種子發(fā)芽率較低，分別為2778%、556%。云南野生楊梅種子及東魁楊梅種子不經(jīng)濃硫酸處理可以完成發(fā)芽，荸薺種楊梅種子通過濃硫酸處理6 min可以促進萌芽。

關鍵詞：楊梅；發(fā)芽率；發(fā)芽勢；濃硫酸；種子萌發(fā)

中圖分類號： S667601文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0211-03[HS][HT9SS]

[HJ14mm]

收稿日期：2014-03-14

基金項目：國家林業(yè)局“948”項目（編號：2011-4-45；西南林業(yè)大學“大型儀器設備共享基金”。

作者簡介：陶燕藍（1987—，女，云南玉溪人，碩士，從事森林生態(tài)學研究。Tel：（087163848118；E-mail：emilytyl@qqcom。

通信作者：藍增全，碩士，教授，從事森林生態(tài)學研究。E-mail：kmlanzengquan@qqcom；吳田，博士，副教授，從事植物生物技術方面的研究，E-mail：461257271@qqcom。[HJ]

楊梅（Myrica rubra是楊梅科（Myricaceae楊梅屬常綠喬木，因其果實形似水楊子、味似梅子而得名。楊梅是我國亞熱帶特產(chǎn)水果之一，素有“初凝一顆值千金”之美譽，在吳越一帶又有“楊梅賽荔枝”之說[1]。全世界楊梅科植物約有3屬50種，原生于我國的楊梅則有1屬4種及1變種，即青楊梅（M adenophora、毛楊梅（M esculenta、矮楊梅（M nana和楊梅（M rubra4種，[JP2]產(chǎn)西南部至東部。楊梅經(jīng)濟壽命長，而且具有固氮能力，既是擁有較高生態(tài)效益和經(jīng)濟效益的經(jīng)濟、生態(tài)林兼用的優(yōu)良樹種，同時也是一個優(yōu)良的生物防火樹種，被人們譽為“綠色企業(yè)”和“搖錢樹”。楊梅的栽培歷史悠久，生態(tài)環(huán)境多樣，栽培中形成了性狀各異的品種、品系和類型，種質資源非常豐富[5]。云南具有得天獨厚的自然條件優(yōu)勢，1985年引進東魁、荸薺種、丁岙梅等楊梅品種進行試種[6]，取得較好經(jīng)濟效益，隨后在石屏、富民、西疇等縣得到了快速發(fā)展[7-10]。加之云南省的楊梅比外省的一般提早成熟30 d左右，品質較好，在國內(nèi)外市場頗具競爭力[11]。

云南野生楊梅資源豐富，據(jù)調(diào)查顯示，國內(nèi)6 種楊梅屬植物中云南就有5 種[12-14]。云南野生楊梅——滇楊梅（Myrica nana Cheral又名云南楊梅、矮楊梅，是云南特有的果樹，普遍分布在云南省中亞熱帶溫涼地區(qū)[15]。荸薺種楊梅（Myrica rubra Biqi因果實成熟時紫黑色，似荸薺而得名，原產(chǎn)于余姚。東魁楊梅（Myrica rubra cv Dongkui因果特大而著稱，發(fā)源地為浙江省臺州市黃巖區(qū)，是目前我國乃至世界最大的楊梅，素有“楊梅王”之稱[16]?，F(xiàn)今，這2個品種都是云南省推廣的主要品種。

發(fā)展果樹，種苗培育較為關鍵。楊梅可用實生、壓條和嫁接繁殖，多用嫁接繁殖[17]。因其種子具有休眠性，種子核殼堅硬，發(fā)芽率、出苗率低，采用種子繁殖成苗率低。以種子為基本材料建立組織培養(yǎng)無菌體系的研究可為楊梅等硬殼類木本植物的繁殖提供參考[18]。相關研究表明，03%～5%硝酸鉀、49%硫酸、赤霉素、熱水浸種能有效打破楊梅種子休眠[19]，60～90 ℃熱水浸種對促進美國臘楊梅種子發(fā)芽效果明顯[20]，采用層積或秋播也可提高種子出苗率[21]，直接用GA3處理取代暖低溫組合層積處理也可促進種子發(fā)芽[22]；但是對于云南野生楊梅和荸薺種楊梅種子萌發(fā)方面的研究報道不多。本研究探討云南野生楊梅、荸薺種楊梅及東魁楊梅種子的萌芽條件，為下一步建立組織培養(yǎng)無菌體系奠定基礎。

1材料與方法

11材料

[JP2]供試荸薺種楊梅及東魁楊梅成熟果實采自富民縣東村鄉(xiāng)楊梅園，云南野生楊梅采自昆明東郊圓寶山。采后放在通氣性較好的采集袋內(nèi)帶回實驗室，挑選呈紅色或暗紅色的成熟果實，用清水洗去果肉（外果皮濾干備用。楊梅種子包含1個大的胚，胚外緊密附著1層薄膜狀種皮及1層堅硬的內(nèi)果皮。

12方法

用濃硫酸（98%分別處理楊梅種子4、5、6、7 min后，迅速用流動自來水沖洗2 h，在蒸餾水中浸泡48 h。以未經(jīng)濃硫酸處理的同品種種子在蒸餾水中浸泡48 h作為對照。將浸泡后的楊梅種子放入有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)晾干去殼，去掉內(nèi)果皮，余下胚和種皮（薄膜狀備用（圖1和 圖2。各種質同一處理3瓶，每瓶2粒種子，設3次重復。在超凈工作臺上，將經(jīng)濃硫酸預處理的種子用10%次氯酸鈉滅菌5 min后，再用75%乙醇處理30 s，然后用無菌水清洗3 ～ 5次，置于濾紙上吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為07%，pH值58。培養(yǎng)室恒溫25 ℃，先采用暗培養(yǎng)，待芽長至1 cm左右時進行光照培養(yǎng)，光照為 100 μmol/（m2·s，光照時間為12 h/d。于培養(yǎng)10、20、30、40 d分別計算種子發(fā)芽勢，40 d計算種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，用Excel、SPSS115軟件進行數(shù)據(jù)分析。

[J]發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/接種數(shù)×100%；

[J]發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/接種數(shù)×100%；

[J]發(fā)芽指數(shù)=∑當天發(fā)芽數(shù)（Gt/天數(shù)（Dt。

2結果與分析

21各楊梅種子基本形態(tài)特征

東魁楊梅種子較云南野生楊梅和荸薺種楊梅的種子略大，呈不規(guī)則橢圓形，兩頂較尖，有較明顯的縫合線。荸薺種楊梅種子最小，卵形，頂尖微尖，平均重051 g，與果肉易分離。云南野生楊梅種子呈圓形，黃白色，長約13 μm，直徑約 9 μm，密被淺棕色柔毛（圖1。剝殼后的東魁楊梅種子圓潤新鮮，健康飽滿，荸薺種楊梅和云南野生楊梅2者的種子呈暗灰色（圖2。endprint

試驗結果表明，云南野生楊梅和荸薺種楊梅、東魁楊梅種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)存在一定差異（表1：云南野生楊梅種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)明顯好于荸薺種楊梅和東魁楊梅種子。從發(fā)芽勢來看，云南野生楊梅種子發(fā)芽較早，接種10 d后發(fā)芽勢高達90%，荸薺種和東魁2楊梅種子發(fā)芽勢為0%，30 d后云南野生楊梅已經(jīng)完成發(fā)芽，荸薺種直至40 d后仍在發(fā)芽。東魁在20 d時發(fā)芽勢達最大（5%后不再發(fā)芽。對于發(fā)芽率而言，野生楊梅種子發(fā)芽率均高于荸薺種和東魁。發(fā)芽指數(shù)趨勢與發(fā)芽率趨勢一樣，野生種優(yōu)于荸薺種和東魁。

23濃硫酸不同預處理時間對云南野生楊梅種子發(fā)芽的影響

試驗結果表明，濃硫酸不同時間預處理下，云南野生楊梅種子的發(fā)芽率在4444%～7778%之間，其中4 min處理最高[CM（25]，達[G8]7778%，7[G3]min[G8]處理下發(fā)芽率最低。發(fā)芽指數(shù)在

020～035之間，而對照組發(fā)芽率高達8333%，發(fā)芽指數(shù)038。從發(fā)芽勢來看，云南野生楊梅種子經(jīng)濃硫酸處理4、6 min 時，10 d左右發(fā)芽勢較好，20 d后不再發(fā)芽；5、7 min處理時，20 d 時發(fā)芽勢較好；而對照組接種10 d后發(fā)芽勢達最大（90%，20 d后仍陸續(xù)發(fā)芽直至30 d后結束發(fā)芽。0、4、6 min 處理的云南野生楊梅種子發(fā)芽后長勢較好，植株健壯，5、6 min處理的長勢較差，植株矮小瘦弱（圖3。[FL]

[F（W21][TPTYL3tif][F]

[FL（22]

24濃硫酸不同預處理時間對荸薺種和東魁2個楊梅種子發(fā)芽的影響

荸薺種楊梅種子經(jīng)濃硫酸處理6 min時發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最大，分別為2778%和013，其余處理均不發(fā)芽。對照組發(fā)芽率為556%，略低于6 min濃硫酸處理。6 min處理與對照組的發(fā)芽勢在接種20 d后分別為1500%和500%。東魁楊梅種子經(jīng)濃硫酸處理后，均未發(fā)芽。

3結論與討論

因種質不同，相同時間濃硫酸處理下楊梅種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢也存在差異。云南野生楊梅種子的發(fā)芽率較高，荸薺種和東魁2種楊梅種子發(fā)芽率較低。這可能與種子的休眠性有關，種子休眠程度因種質不同而不同[23]，云南野生楊梅種子的休眠性相較后2個品種的種子而言可能較淺。云南野生楊梅種子隨著處理時間的延長，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)明顯低于對照，這可能與濃硫酸的濃度及處理時間有關，濃硫酸處理時間的延長會對種子造成損傷而降低種子的萌發(fā)率。在掌握野生種生物學特性的基礎上，進行人工馴化、采種育苗，對開發(fā)林下資源，推動野生楊梅的栽培和加工更具價值。利用鄉(xiāng)土野生楊梅作為砧木進行良種嫁接已獲得成功[24]。

荸薺種楊梅種子經(jīng)濃硫酸預處理6 min時發(fā)芽率高。楊梅種子種皮堅硬，透水性差，阻礙水分的吸收，同時堅硬的種皮在種子萌發(fā)時胚根的伸展也具有一定的機械阻力[25]，從而阻礙楊梅種子萌發(fā)，用濃硫酸處理可使種子的種皮被酸腐蝕，有利于軟化種皮，降低機械阻力，提高種子的萌發(fā)率。東魁楊梅種子經(jīng)處理后發(fā)芽率較低，可能是由于種子對濃硫酸的耐受性較差，破壞了種子的活力。有研究認為剝掉硬殼留胚和種皮的楊梅種子比沒有去除內(nèi)種皮的種子更易發(fā)芽[26]。但是剝掉硬殼的楊梅種子再經(jīng)10%次氯酸鈉5 min滅菌處理后是否也會失去活性，還有待進一步試驗研究。

植物組織培養(yǎng)中，有效控制污染是利用外植體建立無菌體系成功的關鍵之一。本次試驗均產(chǎn)生污染，其原因可能是濃硫酸預處理有效殺滅種子周圍的細菌和真菌，結合10%次氯酸鈉5 min滅菌處理方法，同時在試驗中操作細心、認真嚴謹，有效降低外植體的污染率，明顯提高無菌苗的誘導率。

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