蘭 西， 吳松權(quán)， 金美玉， 全雪麗

( 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133000)

松口蘑( Tricholoma matsutake) 被譽(yù)為菌中之王［1-2］，目前還不能實(shí)現(xiàn)人工栽培［3］。松口蘑營養(yǎng)豐富，據(jù)不完全的資料數(shù)據(jù)顯示它含有17 種氨基酸和多種維生素。除了可食用外，松口蘑還具有很高的藥用價(jià)值。它具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、平喘祛痰、鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗過敏等療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明松口蘑還可治療糖尿病，并具有抗癌作用［4］。假松口蘑( Tricholoma bakamatsutake) 又稱傻松口蘑、青紅松茸、櫟松口蘑、傻松茸、櫟松茸或青岡菌等，與松口蘑同為口蘑屬，屬于典型的營養(yǎng)共生型外生菌根菌［5］，主要分布在中國四川、云南、吉林等地［6］。假松口蘑個(gè)體與松口蘑比較相對較小，但形態(tài)、風(fēng)味十分相近。常被混入松口蘑中銷售，影響中國松口蘑品質(zhì)。近幾年用于區(qū)分兩者的分子標(biāo)記如基于ITS 的ISSR 標(biāo)記［6-8］以及基于RAPD 轉(zhuǎn)換的SCAR 標(biāo)記［9］陸續(xù)被開發(fā)，但基于SRAP 的假松口蘑的SCAR 特異性標(biāo)記的尚未見到報(bào)道。SRAP 具有設(shè)計(jì)簡單，中等產(chǎn)量，在基因組中分布均勻等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳評價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)錄圖譜繪制［10］。SCAR 標(biāo)記技術(shù)是在序列未知的DNA 標(biāo)記基礎(chǔ)上，對特異PCR 片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測序，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列重新設(shè)計(jì)引物，使得擴(kuò)增位點(diǎn)單一［11］。SCAR 用了1 對互補(bǔ)到專一基因組位點(diǎn)上的長引物和嚴(yán)格的PCR 條件，排除了引物結(jié)合位點(diǎn)之間的競爭，因而得到可靠、可重復(fù)的條帶［12］。

本研究擬基于SRAP 標(biāo)記構(gòu)建假松口蘑的SCAR 特異性分子標(biāo)記，以便在分子水平上快速、準(zhǔn)確地鑒定出假松口蘑。

1 材料與方法

1.1 材料

從黑龍江省牡丹江市、吉林省汪清縣、吉林省安圖縣采集的松口蘑和假松口蘑子實(shí)體經(jīng)吉林省松口蘑專家傅偉杰教授鑒定之后，放入－75 ℃超低保溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組總DNA 提取

采用CTAB 法提取松口蘑和假松口蘑子實(shí)體的DNA［13］。

1.3 SRAP 分析

1.3.1 松口蘑和假松口蘑基因池的建立 采用BSA 方法［14］，選取5 個(gè)松口蘑子實(shí)體和5 個(gè)假松口蘑子實(shí)體，分別按每個(gè)樣品500 ng 等量混合成松口蘑池和假松口蘑基因池。松口蘑與假松口蘑來源如表1 所示。

表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 Samples and their origins

1.3.2 SRAP 反應(yīng)體系 總體積為20.0 μl，包括模板5 ng/μl DNA 2.0 μl，2 μmol 引物各2.0 μl，2 mmol dNTP 2.0 μl，2.5 U/μl B Taq DNA 聚合酶0.4 μl( Toyobo 公司) ，10 ×B Taq buffer 2.0 μl，剩余用雙重蒸餾水補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增條件: 預(yù)變性94 ℃，5 min; 變性94 ℃1 min，退火35 ℃1 min，延伸72℃1 min，5 個(gè)循環(huán);變性94 ℃1 min，退火50 ℃1 min; 延伸72 ℃1 min，36 個(gè)循環(huán);最后延伸72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物放在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，用Dolphin 凝膠成像儀拍照保存。

1.3.3 特異性片斷的回收、克隆和測序 將目的DNA 片斷切下后，按照康為世紀(jì)公司膠回收試劑盒說明書回收。提取質(zhì)粒DNA 后，用M13 引物進(jìn)行鑒定。鑒定的陽性克隆委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.4 假松口蘑的SCAR 特異引物設(shè)計(jì)和PCR 擴(kuò)增

根據(jù)測序結(jié)果和引物設(shè)計(jì)原則用Primer premier 5 設(shè)計(jì)假松口蘑的SCAR 特異性上游引物Tb-1(5'-TAAGCTGTGATGAGGGTGTC-3') ，下游引物Tb-2(5'-TGAGTGTCGTCGTATGTAAGTAA-3') 。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。PCR 反應(yīng)總體積為20 μl，除上、下游引物(2 μmol) 各2 μl，其余成分與方法1.3.2 PCR 反應(yīng)體系相同。

假松口蘑的SCAR 特異性PCR 程序?yàn)? 預(yù)變性94 ℃5 min;變性94 ℃30 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，循環(huán)30 次;最后延伸72 ℃5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 標(biāo)記

以松口蘑和假松口蘑基因池DNA 為模板從300 對引物組合中( ME1 ～ME10 和EM1 ～EM30) ，篩選出1 對對假松口蘑具有特異性的引物，即ME1( 5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3') 、EM10( 5'-TGTGGTCCG CAAATTTAG-3') 。用這對引物對構(gòu)成松口蘑和假松口蘑基因池DNA 的每個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果( 圖1) 顯示，在假松口蘑中每個(gè)單株均能擴(kuò)增出1 條1 100 bp 左右的條帶，在松口蘑的單株中卻沒有擴(kuò)增出這一條帶。

圖1 引物對ME1/EM10 對松口蘑、假松口蘑的單株P(guān)CR 圖Fig.1 PCR results of T. matsutake and T.bakamatsutake with the primer pair of ME1/EM10

2.2 目的片段的測序與分析

將目的條帶回收克隆并經(jīng)PCR 鑒定的陽性克隆委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。假松口蘑特異性目的片段序列長度為1 168 bp( 圖2) ，與預(yù)測的長度相近，表明假松口蘑特異性標(biāo)記正確。

2.3 假松口蘑的SCAR 特異性分子標(biāo)記的建立

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)了1 對假松口蘑特異性引物Tb-1 和Tb-2 ( 圖2) ，對松口蘑和假松口蘑基因池DNA 的每個(gè)單株重新擴(kuò)增。在Tb-1 和Tb-2 引物擴(kuò)增中，假松口蘑均能擴(kuò)增出502 bp 特征條帶，而松口蘑未能擴(kuò)增出任何條帶( 圖3) ，與預(yù)測的結(jié)果相同。

圖2 假松口蘑目的片段的堿基序列Fig.2 The base sequence of target fragment of T.bakamatsutake

2.4 假松口蘑SCAR 特異性分子標(biāo)記的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證假松口蘑的SCAR 特異性分子標(biāo)記，我們用假松口蘑的SCAR 特異性引物( Tb-1、Tb-2) 對源自吉林省龍井市、云南省昆明市、日本、云南省寶山鎮(zhèn)等不同地區(qū)的松口蘑和源自云南省麗江市、吉林省安圖縣、吉林省龍井市等不同地區(qū)的假松口蘑進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，結(jié)果( 圖4) 顯示，假松口蘑的SCAR 特異引物在所檢測的來源不同地區(qū)的假松口蘑中均擴(kuò)增出502 bp 特異片段，而松口蘑未擴(kuò)增出任何條帶，表明假松口蘑的SCAR 特異性分子標(biāo)記的可靠性。

3 討論

圖3 特異引物對Tb-1/Tb-2 對松口蘑、假松口蘑基因池DNA的每個(gè)單株的PCR 圖Fig.3 PCR of individuals of T. matsutake and T. bakamatsutake with primer pairs of Tb-1/Tb-2

圖4 特異引物對Tb-1/Tb-2 對松口蘑和假松口蘑的PCR 圖Fig.4 PCR of T.matsutake and T. bakamatsutake with primer pairs of Tb-1/Tb-2

松口蘑的營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于假松口蘑，由于不能進(jìn)行人工栽培，目前出售的松口蘑都是野生的，是一種純天然的食用菌，價(jià)格是假松口蘑的10 倍。從形態(tài)上很難鑒定出松口蘑和假松口蘑，分子標(biāo)記經(jīng)常用于鑒定物種的真?zhèn)危肿訕?biāo)記技術(shù)能夠提供大量的遺傳信息，是研究種質(zhì)資源遺傳多樣性、植物進(jìn)化和近緣種親緣關(guān)系的有效工具。分子標(biāo)記能有效地確定群體的起源和系統(tǒng)關(guān)系，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)出該種群或個(gè)體的本質(zhì)特征［15］，在表型難以區(qū)分的分類群的遺傳關(guān)系的確定方面尤為重要［11］。分子標(biāo)記鑒定結(jié)果準(zhǔn)確且成本低，實(shí)驗(yàn)操作方便，可以在實(shí)驗(yàn)室操作，不需要等待生物生長的周期，也不受外界環(huán)境條件的影響［16］。目前區(qū)別不同物種的分子標(biāo)記的方法很多，如RAPD、ITS、SRAP、SCAR 等。

沙濤等［4］利用松口蘑與假松口蘑已有的基因，根據(jù)其長度的大小將松口蘑與假松口蘑區(qū)別開，而本試驗(yàn)是基于特異基因序列的有無來鑒別松口蘑與假松口蘑，相比之下本試驗(yàn)結(jié)果更可靠。吳松權(quán)等［9］在RAPD 分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上根據(jù)序列的有無建立了松口蘑特異性SCAR 標(biāo)記，但本試驗(yàn)應(yīng)用的SRAP 方法比RAPD 方法可獲得更多的多態(tài)性條帶，試驗(yàn)的準(zhǔn)確性大大提高。張微思等［7］和李強(qiáng)等［8］利用ISSR 方法分析松口蘑的多態(tài)性條帶，確定其遺傳多態(tài)性及近緣種的同源性，但沒有對松口蘑與假松口蘑進(jìn)行區(qū)分。本研究在SRAP 分子標(biāo)記基礎(chǔ)上根據(jù)基因序列的有無，發(fā)現(xiàn)了假松口蘑的特異序列，同時(shí)根據(jù)其特異序列分別設(shè)計(jì)了1 對特異引物，建立了假松口蘑的SCAR 特異性的分子標(biāo)記。

目前在區(qū)別松口蘑與假松口蘑的試驗(yàn)中，大部分是針對松口蘑而建立的特異性標(biāo)記，而針對假松口蘑標(biāo)記的報(bào)道還未見到。因此，本試驗(yàn)首次建立了假松口蘑的特異性標(biāo)記。

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