楊培新， 鄭銳東， 羅集豐， 謝桂勉， 鄭鋼勇， 方培煒， 蔡佳維

(1.揭陽職業(yè)技術學院生物工程系，廣東 揭陽522000;2.揭陽職業(yè)技術學院實訓中心，廣東 揭陽522000;3.揭陽職業(yè)技術學院師范教育系，廣東 揭陽522000)

纖維素是地球上分布最廣、數(shù)量最大的可再生資源［1-5］。據(jù)統(tǒng)計，僅中國每年即產(chǎn)生約6.9 ×108t農(nóng)作物秸稈和纖維素廢棄物［6］，然而受限于化學、生物轉化技術，大量纖維素廢棄物只能通過堆積、焚燒等落后方式直接進入環(huán)境，造成嚴重的污染和資源浪費。隨著微生物資源的逐步開發(fā)、微生物技術的日趨成熟，利用微生物降解纖維素進而轉化成高附加值產(chǎn)品成為可能［7］，中國科學院、山東大學等機構先后對此領域開展了大量研究，并取得突破［6］。目前，微生物轉化因具有經(jīng)濟、高效、節(jié)約等優(yōu)點而成為開發(fā)利用纖維素資源的熱門課題［8-10］。隨著研究的推進，大規(guī)模纖維素微生物轉化工藝的發(fā)展，將有效解決糧食危機、資源危機、環(huán)境污染等全球性難題。但纖維素酶用量大、成本高是限制其應用的一個重要因素［11］，因此選育出產(chǎn)酶高、生長快的合適菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高纖維素酶產(chǎn)量具有重要的意義［8］。

自然界中存在能夠降解纖維素的眾多微生物資源。近些年關于產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選研究也很多，但真正高產(chǎn)量的菌株并不多見。本研究從常年堆積廢氣竹筍殼的土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶真菌，并在單因素試驗基礎上對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自廣東省揭陽市埔田鎮(zhèn)長期堆積竹筍殼廢棄物的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基［1］CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)培養(yǎng)基、纖維素剛果紅培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選［1］樣品用無菌水進行系列稀釋并涂布于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，菌落呈紅色且能在周圍形成透明水解圈的菌株即為能產(chǎn)纖維素酶的菌株。挑出其中生長快、顏色深且水解圈直徑大的菌落，分別接種于含濾紙條的赫奇遜培養(yǎng)基中，30 ℃，140 r/min培養(yǎng)5 d。挑選濾紙條崩解充分的菌株，并于CMC-Na 培養(yǎng)基上涂板、劃線，反復篩選純化菌株。

1.2.2 菌株的鑒定 形態(tài)鑒定:菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，進行菌落形態(tài)觀察，同時取少量菌絲于顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。ITS 分析:采用CTAB 法抽提菌株基因組DNA，以其為模板，以通用引物ITS1(5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAA-3')為擴增引物。PCR 反應條件:95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min 30 s，24 個循環(huán)，72 ℃10 min，10 ℃。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測合格后進行測序(由上海美吉生物公司完成)。將所得序列通過Blast 程序和GenBank 核酸數(shù)據(jù)進行比對，采用ClustalW 進行多序列匹配排列，通過MEGA6.06軟件包中的Kimura 2-parameter 方法計算進化距離，用N-J 法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 纖維素酶活測定方法 采用DNS 法［12］。酶活定義:在pH5.0、50 ℃下每1 ml 酶液在1 min 內水解CMC-Na 生成1 μg 葡萄糖的酶活性為1 個纖維素酶活性(CMC 酶活)單位(IU)。酶活的計算:CMC 酶活性=［(G×B)/(2.5×30)］×103，式中G 為樣品中葡萄糖含量(μg)，B 為酶液稀釋倍數(shù)，2.5 為吸取酶液的體積(ml)，30 為糖化時間(min)。

1.2.4 標準曲線 標準曲線參照文獻［13］。

1.2.5 單因素試驗［14］在前期培養(yǎng)基各組分、各發(fā)酵條件單因素試驗基礎上，選取其中對發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響較明顯的3 個因素(初始pH 值、CMCNa 濃度和酵母膏濃度)作為重點研究對象。以CMC-Na 培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以纖維素酶活為指標，分別研究不同初始pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、CMC-Na濃度(5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)和酵母膏濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L)對菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響。

1.2.6 優(yōu)化方法 根據(jù)前期單因素試驗所篩選的最佳初始pH 值、CMC-Na 和酵母膏濃度，應用3 因素3 水平的Box-Behnken 設計［15］，以纖維素酶活性為響應值，采用響應面法進行分析，試驗因素及水平見表1。響應面試驗結果運用Design Expert7.0 分析軟件進行方差分析。為了驗證所得結果的可靠性，結合實際試驗條件，在優(yōu)化條件下進行驗證試驗，做3 次平行試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

從埔田地區(qū)長期堆放竹筍殼廢棄物土壤中經(jīng)過剛果紅透明圈法篩選分離到1 株具有較強降解纖維素能力、生長速度較快且長勢旺盛的產(chǎn)纖維素酶真菌(暫定名為cel403)。該菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌落呈圓形，邊緣平整，有白色菌絲，表面粗糙，布滿一層孢子粉，孢子呈暗綠色(圖1)。在纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上有透明圈(圖2)。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

圖1 產(chǎn)纖維素酶真菌cel403 在PDA 斜面上的生長Fig.1 Growth of cellulase-producing fungus cel403 on PDA medium

圖2 cel403 在纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上形成的透明圈Fig.2 Transparent zones of cel403 on the congo red plates

通過顯微鏡觀察，菌體呈絲狀，菌絲發(fā)達，多分枝，菌叢呈黑褐色，頂囊球形，小梗雙層，分生孢子梗從膨大的菌絲細胞上垂直生出(圖3)，分生孢子為球形(圖4)。根據(jù)菌落形態(tài)觀察及顯微鏡鏡檢結果，參考《真菌鑒定手冊》［16］，初步確定該菌為曲霉屬。

2.2 ITS 分析結果

圖3 cel403 菌絲形態(tài)(×1 000)Fig.3 Mycelium morphology of cel403(×1 000)

圖4 cel403 孢子形態(tài)(×1 000)Fig.4 Spore morphology of cel403(×1 000)

提取菌株cel403 基因組DNA 并進行PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖5。PCR 擴增獲得1 條約550 pb 的亮帶。測序后，使用BIOEDIT 軟件進行拼接，得到該菌的ITS 序列，長度為564 pb，序列如下:TCCGTAGGGGAACCTGCGGAAG GATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCA ACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCG GCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGAC TACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAG TCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGG ATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA ACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGG CATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT GCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTC CCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGC ACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCA CCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGAC GTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCA GGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA GCGG。

圖5 電泳檢測ITS PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR product of ITS rDNA

將該序列提交GenBank，登錄號為KM233157。采用Blast 軟件比對，同源性高(98%以上)的均為Aspergillus(曲霉屬)。根據(jù)序列同源性從高到低順序選取6 株菌株，利用Mega6.06 構建系統(tǒng)進化樹(圖6)，結果顯示菌株cel403 與Aspergillus versicolor NRRL58999 處于同一分支，親緣性最近，由此判斷該菌為Aspergillus versicolor(雜色曲霉)。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 發(fā)酵時間 發(fā)酵時間的長短直接影響纖維素酶活性。發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響如圖7 所示。纖維素酶活性隨發(fā)酵時間的延長而提高，至發(fā)酵第6 d 達到最高點，之后逐漸下降。為減少發(fā)酵成本，降低染菌概率，選擇6 d 為最佳發(fā)酵時間。

圖6 菌株cel403 ITS 系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain cel403 and related strains based on ITS

圖7 不同發(fā)酵時間對菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.7 Influence of different fermentation time durations on the activity of cellulase produced by strain cel403

2.3.2 碳源和氮源含量及初始pH 值 由圖8、9、10 可直觀看出，不同的初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度均會對菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)生影響，其中以初始pH、CMC-Na 濃度尤為顯著。在選取的范圍內，分別在pH7、CMC-Na 濃度15 g/L、酵母膏濃度1.0 g/L時，發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性出現(xiàn)峰值，故以上述數(shù)值為中心值，并圍繞該值選擇自變量范圍進行Box-Behnken 試驗設計。

2.3.3 Box-Behnken 試驗設計結果與分析［17-18］綜合分析單因素試驗結果，確定初始pH、CMC-Na濃度和酵母膏濃度3 個因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken 設計原理，以纖維素酶活性為響應值設計試驗。響應面試驗設計及結果見表2。

圖8 不同培養(yǎng)基初始pH 值對菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.8 Effects of different initial pH values of the medium on the activity of cellulase produced by strain cel403

圖9 不同CMC-Na 濃度對菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.9 Effects of different CMC-Na concentrations on the activity of cellulase produced by strain cel403

圖10 不同酵母膏濃度對菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.10 Effects of different yeast extract concentrations on the activity of cellulase produced by strain cel403

采用Design-Expert7.0 軟件對表2 試驗結果進行二次多項回歸擬合，獲得發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性對初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度的二次多項回歸方程:Y = 81.92 + 5.75X1+4.75X2+ 2.23X3+。方差分析結果表明，該模型顯著(P=0.001 3)，失擬項不顯著(P =0.086 8)。該模型確定系數(shù)R2= 0.944 3，校正系數(shù) Radj2=0.872 6，說明模型與實際情況擬合較好，可有效預測Aspergillus cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性情況。對回歸方程取一階偏導等于0 并整理可得模型極點坐標為:X1=7.11，X2=15.60 g/L，X3=1.09 g/L。此時，模型預測最大纖維素酶活性為83.44 IU/ml。從初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度交互影響纖維素酶活的響應面圖(圖11)可直觀看出各因素對響應值影響的變化趨勢。

表2 Box-Behnken 設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.4 驗證試驗

經(jīng)過上述響應曲面優(yōu)化，得到菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)方案如下:培養(yǎng)基組成為CMCNa 15.60 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、NaCl 0.10g、NaNO32.50 g、FeCl31 mg、CaCl20.10 g、酵母膏1.09 g，H2O 1 000 ml，pH7.1;30 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)6 d。以未經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件作為對照，進行方案驗證。結果表明發(fā)酵條件未經(jīng)優(yōu)化和優(yōu)化后獲得纖維素酶活性分別為77.95 U/ml 和89.66 U/ml，通過優(yōu)化酶活性提高了15.02%。

3 結論

圖11 初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度交互影響纖維素酶活性的響應面圖Fig.11 Response surface of cellulase activity produced by cel403 affected by the interaction between initial pH，CMC-Na concentration and yeast extract concentration

從長期堆放竹筍殼廢棄物土壤中經(jīng)過剛果紅透明圈法篩選分離到1 株具有較強降解纖維素能力并生長速度較快且長勢旺盛的產(chǎn)纖維素酶真菌。經(jīng)形態(tài)特征觀察、ITS 分析，并構建該菌株系統(tǒng)進化樹，初步鑒定該菌為曲霉屬，暫定名為Aspergillus cel403。采用單因素試驗研究了初始pH、CMC-Na濃度和酵母膏濃度對菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響，在此基礎上運用響應面分析得出最佳發(fā)酵條件:培養(yǎng)基組成為CMC-Na 15.60 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、NaCl 0.10g、NaNO32.50 g、FeCl31 mg、CaCl20.10 g、酵母膏1.09 g，H2O 1 000 ml，pH7.1;30 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)6 d。在該條件下，菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性為89.66 IU/ml，比石文卿等［12］分離到的纖維素酶真菌D1 產(chǎn)酶活性(CMC 酶活31.12 IU/ ml)高，具備進一步開發(fā)潛能。

［1］ 孟建宇，馮福應，劉向紅，等. 1 株纖維素降解菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究［J］.微生物學雜志，2011，31(4):47-49.

［2］ 范曉娟，朱紅梅，韓士群，等.白腐菌對水葫蘆木質纖維素的降解及對厭氧發(fā)酵的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2013，29(5):1043-1050.

［3］ 王明月，畢榮璐，王金華，等.板栗苞殼纖維素降解真菌的篩選及降解效果［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42(5):290-293.

［4］ 陳 華，廖崇靜，馮 珊，等.酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42(6):252-254.

［5］ 王 璐，張海紅，楊 柳，等.3 株纖維素分解真菌的分子鑒定［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41(8):51-53.

［6］ 林海龍，武國慶，羅 虎，等.我國纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀［J］.糧食與飼料工業(yè)，2011(1):31.

［7］ REGINA V，ALGIMANTAS P，VITA R. Cellulose degradation in rye straw by micromycetes and their complexes［J］. Ekologija，2008，54(1):29.

［8］ 楊曉宸，盧雪梅，黃 峰. 木質纖維素微生物轉化機理研究進展［J］.纖維素科學與技術，2007，15(1):52-57.

［9］ 費 嵐，邵 飛，賈 睿，等. 滸苔纖維素分解菌株的篩選、鑒定與纖維素酶活特性研究［J］. 上海海洋大學學報，2014，3(23):412.

［10］ 方 詡，秦玉琪，李雪芝，等.纖維素酶與木質纖維素生物降解轉化的研究進展［J］.生物工程學報，2010，26(7):865.

［11］ PHITSUWAN P，LAOHAKUNJIT N，KERDCHOECHUEN O，et al. Present and potential applications of cellulases in agriculture，biotechnology and bioenergy［J］. Folia Microbiological，2013，58(2):163-176.

［12］ 石文卿，陶能國，劉躍進，等. 一株高產(chǎn)纖維素酶真菌的分離及產(chǎn)酶特性研究［J］.環(huán)境工程學報，2011，6(5):1435-1440.

［13］ 張 粲，武改紅，赫榮琳，等.纖維素酶高產(chǎn)菌株檜狀青霉9-3的誘變選育及產(chǎn)酶條件研究［J］. 基因組學與應用生物學，2014，33(3):568-569.

［14］ 朱曉媛，胡 鐵，張 蕾，等. Penicillium sp.1407 產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國糧油學報，2014，29(5):115-117.

［15］ 黃達明，張 雪，管國強，等.響應面法優(yōu)化混菌發(fā)酵豆粕的條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2014(13):224-228.

［16］ 張紀忠.真菌鑒定手冊［M］.上海:復旦大學出版社，1990.

［17］ AKHIR S M，ABD-AZIZI S，SALLEH M M，et al. Bacillus licheniformis TH-1 by response surface methods［J］. Biotechnology，2009，8(1):120-125.

［18］ SHI L E，YING G Q，ZHANG X Y，et al. Medium optimization for 5'-phosphodiesterase production from Penicillium citrinum using response surface methodology［J］. Food Technol Biotechnol，2007，45(2):126-133.